[发明专利]一种百合斑驳病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂卡及制备方法，具体的是一种用胶体金免疫层析法快速检测百合斑驳病毒(LMoV)的试剂卡及其制备方法。

背景技术

百合(Lilium spp)是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物。2005年，观赏百合主要生产国荷兰的面积达到3800hm²，占全球总面积的72％，每年生产22.1亿个百合种球，其中约1.0亿个出口到中国。甘肃省兰州市及其周边定西、临夏等地区食用百合的面积已近10000hm²，直接参与百合种植的农户已超过9万户，百合已成为产区农户的主要收人来源。尽管上世纪80年代末我国就开始了百合切花生产，但由于百合种球繁育技术以及病毒检测等技术的落后，导致自繁种球质量差、增重慢、感病严重，生产中使用的种球90％以上依赖进口，耗资巨大。更重要的是进口种球价格高，病毒病却没有保障，导致我国百合切花生产成本居高不下而切花质量却参差不齐，严重影响了百合产业的健康、高效发展。食用百合种植一茬需要3～5年的时间，主产区受土地面积的限制，重茬严重。连茬引发的病害尤其病毒病严重影响了食用百合的生长，使百合产量降低，品质下降，经济效益减少。

目前文献报道侵染百合的病毒有20多种，其中百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)和百合隐症病毒(Lily symptomless virus，LSV)是发生最普遍、危害最严重的两种病毒，其他病毒均为局部地区发生。LMoV可在世界范围内广泛分布，特别是在适合其寄主生长的所有温带地区及蚜虫媒介丰富的地区尤为普遍。LMoV侵染百合科植物常造成叶片有斑驳条纹甚至坏死斑，后期发展为花、叶片卷曲畸形，开碎色花，并常伴随植株矮小、花与球茎的减产等。百合斑驳病毒属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小(650～900)nm×(11～15)nm。病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly(A)尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0kDa的多聚蛋白。多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白(CP)等10个不同大小的功能蛋白。LMoV CP亚基由274aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。

目前与百合病毒相关的研究主要集中在病毒脱除和病毒检测上，病毒检测研究虽然有电子显微镜技术、酶联免疫法(ELISA)以及分子生物学技术(RT-PCR和基因芯片技术)等的相关报道，但都还停留在研究和实验室阶段，无法满足百合种植现场及田间快速检测的需求，从而无法掌握百合病毒感染的准确信息。此外，包括ELISA和RT-PCR等方法在内的传统实验室检测方法都存在程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成等实际问题，因此使用范围受到很大的局限性。

胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体。该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于多种植物病毒的检测等，包括马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等。作为一种快速筛查的手段，既可节省检测成本，又可用于广大基层单位开展百合病毒的检测和防控工作中，具有重要的经济价值和社会价值。但是至今国内外还没有用胶体金免疫层析法检测LMoV的相关报道，更无商品化的LMoV胶体金免疫层析检测试剂卡，很难满足国内观赏及食用百合的病毒检测需求。因此建立科学、快速、灵敏、稳定、易操作的LMoV检测方法及试剂卡，是生产百合脱毒株的基础，是提高百合产量和品质的前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种用胶体金免疫层析法快速检测LMoV的试剂卡及其制备方法。本发明试剂卡检测快速，检测准确率高，特异性强，携带方便，操作简便，检测重复性好，无需任何仪器和设备。

本发明的技术方案为：