[发明专利]一种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂卡及制备方法，具体是一种用胶体金免疫层析法快速检测百合隐症病毒(LSV)的试剂卡及其制备方法。

背景技术

百合(Lilium spp)是传统的药用和食用植物，现已成为国际上重要的球根花卉之一。荷兰是世界上最大的百合种球生产国，2005年荷兰百合种球生产面积达3800hm²，占全球总面积的72％，每年生产22.1亿个百合种球，其中约1.0亿个出口到中国。切花百合在我国花卉产业产值中占第四位，同时百合作为食品和药材，也是一种重要的经济作物。兰州食用百合由于其色泽洁白、形大味甜、营养丰富等特点享誉海内外。近年来，兰州市及其周边定西、临夏等地区食用百合的面积已近10000hm²，直接参与百合种植的农户已超过9万户，已成为产区农户的主要收人来源。随着百合种植面积日益扩大，长期无性繁殖使病毒不断积累，造成百合种性衰退，严重影响了产量和品质，给世界各地百合生产带来了巨大的经济损失。我国百合产区病毒病发生范围广、为害严重，云南、甘肃、江苏等百合产区病毒病的自然发病率一般在20％～30％，有的达70％以上，严重者可高达100％。病毒病已成为危害百合生产的主要病害，也是限制我国百合生产和切花出口的重要原因之一。

目前文献报道侵染百合的病毒有20多种，其中百合隐症病毒(Lily symptomless virus，LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)是发生最普遍、危害最严重的两种病毒，其他病毒均为局部地区发生。正常条件下，LSV并不会引起百合植株产生明显症状，但会使鳞茎缩小，切花寿命减短。LSV与LMoV复合侵染时，导致百合出现坏死斑，并常伴随植株矮小、花与球茎的减产等。LSV属于麝香石竹潜隐病毒属(Carlaviru)成员，其病毒成员多呈直形，大约占64％，弯曲形也较为常见，占36％。病毒典型长度介于509～720nm之间，直径介于11～13nm或者14～18nm。病毒基因组为不分段RNA，全长8.4kb，其中包括5′端的帽子结构和3′的poly(A)尾巴，具有6个开放阅读框(ORF)，编码包括外壳蛋白(CP，32kDa)在内的6个蛋白。其中CP亚单位是LSV基因组6个开放阅读框编码的唯一参与病毒颗粒形态构成的蛋白质，其ORF长度为876nt。CP亚单位围绕病毒RNA分子，组装成病毒外壳。

目前与百合病毒相关的研究主要集中在病毒脱除和病毒检测上，病毒检测研究虽有电子显微镜技术、酶联免疫法(ELISA)以及分子生物学技术(RT-PCR和基因芯片技术)等的相关报道，但都还停留在研究和实验室阶段，无法满足大规模检测以及百合种植现场和田间快速检测的需求，从而无法掌握百合病毒感染的准确信息。此外，包括ELISA和RT-PCR等方法在内的传统实验室检测方法都存在程序复杂，检测成本高、耗时长、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成等问题，因此应用范围受到很大的局限性。

胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体。该方法可以避免以上几种检测方法的缺点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接受，已用于多种植物病毒的检测等，包括马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草斑驳病毒、南瓜花叶病毒等。作为一种快速筛查的手段，既可节省检测成本，又可用于广大基层单位开展百合病毒的检测和防控工作中，具有重要的经济价值和社会价值。但是至今国内外还没有用胶体金免疫层析法检测LSV的相关报道，更无商品化的LSV胶体金免疫层析检测试剂卡，很难满足国内观赏及食用百合的病毒检测需求。因此建立科学、快速、灵敏、稳定、易操作的LSV检测方法及试剂卡，是生产百合脱毒株的基础，是提高百合产量和品质的前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种用胶体金免疫层析法快速检测LSV的试剂卡及其制备方法。本发明试剂卡检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测重复性好，无需任何仪器和设备。

本发明的技术方案为：