[发明专利]基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物物理学分析检测技术领域，涉及一种赭曲霉毒素A检测的方法。

背景技术

赭曲霉毒素A（OTA）是粮食制品易污染的真菌毒素，对人体危害极大。加强对它的检测监控对维护人类健康有着重要意义。目前快速筛查方法多为基于免疫学检测方法对其进行定性定量分析，如酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫层析柱测定法和基于不同标记物显色的快速筛查试纸条等等。

1993年比利时科学家首次在Nature报道：在骆驼科动物血液中的抗体，只包含一个重链可变区(variable domain of heavy chain of HCAb, VHH)和两个常规的CH2与CH3区，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。其相对分子质量为15 000，仅为常规抗体的1/10左右，分子高度4.8 nm，直径2.2 nm，所以VHH也称纳米抗体或单域抗体。

荧光共振能量转移（F?rster resonance energy transfer，简称FRET），是指受激发的能量供体将能量传递给基态受体的一个非辐射能量转移过程，它对能量供受体对之间的距离及相对偶极方向的纳米范围内变化非常敏感，只有在非常近的距离（10 nm）以内，才能够发生有效的能量共振转移，且这种能量转移效率与供受体之间距离的6次方成反比（见公式1）。因此FRET被称为一种高效的“光学分子尺”，近年来，该技术已经在物理、化学及生物学领域得到了广泛的研究与应用。

公式1：E=nR₀⁶/(n R₀⁶+r⁶)

公式1中E为能量转移效率；n为每个能量供体分子对应的平均能量受体分子个数；r为能量供受体之间的距离；R₀是距离常数。

将单域抗体和抗原分别与能量供受体偶联，抗原抗体间特异性结合会使能量供受体之间靠近并发生能量共振转移。而相对于传统抗体，单域抗体体积小，按照公式1中能量转移效率与能量供受体之间距离6次方成反比，即距离越近检测灵敏度越高，可以大大提高能量转移效率。并且，由于整个反应为均相的免疫学检测反应，免疫学反应效率大大高于目前常规的半固相免疫学反应，既提高了检测灵敏度，又能缩短检测时间，如果配有高通量荧光检测器，可以同时测定大量样品。

量子点是一种随粒径大小变化可激发出不同波长荧光的纳米晶体，随粒径或最大发射波长的变化，量子点呈现出不同的颜色。如在最大发射波长530 nm至550 nm范围内的量子点呈现绿色，而在最大发射波长590 nm至620 nm范围内的量子点呈现红色。量子点的优点是荧光产率高，光稳定性好，激发光谱广而发射光谱窄，并且量子点表面可以修饰任何所需的化学基团，能方便的标记在生物分子上，是作为FRET能量供受体的良好材料。

发明内容

本发明的创新性在于提出了一种新的快速、灵敏和廉价的免疫学定量检测OTA的方法，即基于红、绿量子点间能量共振转移信号来定量检测痕量的OTA。本发明基于两种量子点之间能量转移的OTA检测方法，包括红色量子点与OTA偶联物（试剂1），绿色量子点与抗OTA单域抗体偶联物（试剂2）和结合缓冲液（试剂3）。其中红、绿量子点的选择前提是二者发射光谱没有重叠，且绿色量子点的发射光谱在红色量子点吸收光谱范围内，具体为：绿色量子点最大发射波长介于530 nm至550 nm，表面氨基化修饰；红色量子点最大发射波长介于590 nm至620 nm，表面羧基化修饰。

抗OTA单域抗体由OTA人工抗原免疫羊驼后由羊驼血液中分离获得。