[发明专利]一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法，属于核酸纯化领域。

背景技术

早在1948年，Mandel等就发现了外周血中有游离核酸，但在当时因核酸是否是遗传物质还没有被定论而没有引起人们的关注。随着研究的深入，科学家们意识到，游离核酸不仅可以应用于胎儿性别、RHD血型、Y染色体连锁的遗传疾病的诊断与预防，还可以应用于检测肿瘤、癌症的发生以及骨髓移植后嵌合状态的研究。1989年，Stroun等研究表明，游离核酸中部分基因具有肿瘤组织基因的类似特征；几年后，Vasioukhin等于血浆游离核酸中发现了突变的N-ras，进一步为两者相关性提供了依据。至此，游离核酸开始被用作一种预测肿瘤发生的新型生物标记。近几年，除肿瘤外的其他疾病也出现了游离核酸的报道，如急性(心脑血管疾病)或恶性疾病(系统性免疫疾病)、需机械通气危重症、中风、脊髓小脑性共济失调、心肌梗塞、急性登革热病等。游离核酸对产前诊断同样具有重要意义。Lo等认为，在免疫学上胚胎对于母体类似于肿瘤对于机体，可能在母体血浆中存在游离的胎儿DNA。1997年，他们通过实时PCR从一孕男胎妇女血液游离DNA扩增出胎儿Y染色体特异序列，首次证明孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。随后在1998年，他们发现胎儿游离核酸在妊娠早期便存在于孕妇血液中，且胎儿游离核酸浓度随孕周的延长而增加。同年，他们建立方法，检测孕中期RhD阴性孕妇外周血中是否存在RhD基因，从而揭开了利用母体血浆中游离胎儿DNA进行产前诊断研究的序幕。此外，游离核酸还可用于三体综合征、地中海贫血症、连锁遗传性疾病和早产的产前诊断。

目前提取核酸的的方法主要有苯酚-氯仿抽提法，硅膜离心柱吸附法和磁珠吸附法。苯酚-氯仿抽提法发展的较早，使用比较广泛，主要原理是基于DNA在不同溶剂中溶解行为不同来达到分离纯化DNA目的，其优点在于提取DNA产率较高，成本低廉，主要缺点是费时费力，提取DNA纯度不高，大量使用有毒溶剂，难以实现自动操作。目前市面商品化核酸提取试剂盒大多采用硅膜离心吸附柱方法，该方法简单快速，能有效的去除样本中的各种PCR抑制物，获得较纯的DNA，但是对于游离核酸提取效率低，且成本较高，同时需要高速离心，不适合临床常规使用和高通量操作。磁珠法提取核酸是近几年才发展起来的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要为铁氧体)表面通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有-COOH，-NH2，-OH，-COH，-SH，-SO3等，利用磁珠表面的这些活性基团，以共价键的形式偶联在磁珠的表面，制备成具有磁性的亲和吸附剂，然后与生物样品共同孵育后，目标分子能够迅速被磁珠捕获，可以在磁场作用下从液相中沉降下来，经过简单的洗涤，分离得到表面结合有目标分子的磁珠复合物，通过改变洗涤条件可以将目标分子从磁珠上洗脱下来。其操作简便、快速，获得的核酸纯度高，产量达，对血浆游离核酸提取效率最高，相对丢失率最小，重复性好，尤其适合游离核酸的提取。此外，目前已有很多公司生产出配套磁珠法提取核酸的自动化系统，极大地提高了样品处理的通量，易于高通量的筛选，同时也提高了提取操作的可重复性。而已商品化的磁珠法游离核酸提取试剂盒操作复杂，需要先在56℃条件下用蛋白酶K和裂解缓冲液消化样本，然后冷却至室温后加入无水乙醇混匀，室温放置5分钟后加入磁珠悬浮液进行混匀，经过一系列漂洗步骤后置于室温晾干10-15分钟。步骤的繁琐性导致其自动化操作程度低，仪器普适性差，同时也无法保证核酸提取的重复性。此外很多磁珠法游离核酸提取试剂盒对于血清或血浆样品游离核酸提取效率低，这就导致了其在提取过程中需要更多的起始样本量或者额外添加Carrier RNA或糖原才能满足后续检测的要求，不仅增加了成本，而且增加了临床应用的难度。因此迫切需要开发简单快速、稳定高效和价格便宜的纳米磁珠法游离核酸提取试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提出一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法，同时将血清或血浆样本、裂解缓冲液、蛋白酶K和磁珠悬浮液混合后进行室温孵育，以简化核酸的提取步骤，并避免普通磁珠法核酸提取中需要高温孵育带来的不便。

本发明提出的使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法，包括以下各步骤：

（1）在盛有1.5毫升无核酸酶的离心管中加入200微升血清/血浆样本和300微升裂解缓冲液，得到混合液；

（2）向离心管的混合液中加入20微升蛋白酶K和15微升充分摇匀的磁珠悬浮液，充分混匀，室温下用移液器吹吸或上下颠倒混匀10分钟；