[发明专利]一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法，属于核酸纯化领域。 

背景技术

肝素是由猪、牛或羊的肠粘膜等组织中提取的黏多糖硫酸酯类物质，被世界公认为“生物黄金”，是很多重大疾病及手术治疗的重要临床用药，并在科研中用途广泛。目前年市场额近100亿美元，全球60%以上的肝素钠原料由中国提供。

上世纪90年代以来，受疯牛病、口蹄疫等严重威胁人类健康的传染病影响，牛羊源的肝素制品在生产及使用上被严格控制，各制剂厂均要求药用肝素钠必须单一来源于猪小肠粘膜，一般要求牛羊等基因比例不得超过0.1%。2011年美国食品药品监督管理局（FDA）对肝素钠粗品检测的指导意见为能够对肝素钠物种来源进行定量测定，并具有足够准确性和特异性。 

目前，动物源性成分的检测方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法（即聚合酶链式反应，PCR法）（以下使用简称PCR）。PCR法通过特异检测肝素制品中残留的基因组脱氧核糖核酸（DNA）（以下简称DNA），可以快速灵敏的对肝素的物种来源进行鉴定。但由于肝素对PCR反应具有较强的抑制作用，若要使得这一便捷的测定方法得到广泛推广使用，需要在从肝素制品中提取残留的基因组DNA时有效清除肝素的残留对PCR的影响。现有的清除肝素的主要方法一般是使用肝素酶消化处理样本，但该过程处理时间较长，一般为18小时左右，且由于肝素酶价格昂贵，也在一定程度上限制了PCR测定法的使用。 

发明内容

本发明的目的是提出一种从肝素制品中提取基因组DNA的方法，采用一种特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的裂解体系，以快速简单的从肝素制品中提取残存的基因组DNA，极大地消除了肝素对PCR的抑制，所得产物可方便的用于后续PCR检测。 

本发明提出的从肝素制品中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤： 

（1）称取20毫克肝素钠样品置于1.5毫升离心管中，加入400微升裂解液，振荡混匀后放入65℃水浴锅中保持20分钟，每隔5分钟振荡一次，以使样品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明状；注意裂解液中含有不溶性树脂，使用前应充分振荡混悬。 

（2）将上述混合液置于离心机中进行离心分离，离心分离的转速为12000转/分钟，离心分离时间为5分钟； 

（3）取出步骤（2）中离心分离得到的上清液转入硅膜吸附柱中，将硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，将离心管置于离心机中，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液； 

（4）向步骤（3）的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80℃水浴中，保持10分钟，然后在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离的废液； 

（5）向步骤（4）的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液； 

（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000转/分钟的转速下离心分离30秒，弃去离心分离废液； 

（7）重复步骤（6）2～4次； 

（8）将步骤（7）的硅膜吸附柱放入1.5毫升离心管中，开盖离心分离2分钟； 

（9）将步骤（8）的硅膜吸附柱放入一个新的1.5毫升离心管中，向吸附柱中间悬空加入50微升去离子水，静置2分钟； 

（10）将步骤（9）中装有硅膜吸附柱的离心管在12000转/分钟的转速下离心分离1分钟，收集洗脱液，洗脱液为基因组DNA溶液。 

上述方法中，所述的裂解液的配方为： 

将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，用盐酸将混合液pH值调整为8.3～8.5，定容混合液体积为1000毫升。 

上述方法中，所述的第一漂洗液的配方为： 

异丙醇  450～700毫升 

氯化钠  80～160克 

将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，定容混合液体积为1000毫升。 

上述方法中，所述的第二漂洗液的配方为： 

异丙醇        500～800毫升 

聚乙二醇6000  70～120克 

将上述各组分分别量取后混合，加去离子水，得到混合液，定容混合液体积为1000毫升。 

上述方法中，所述的第二漂洗液的配方为： 

三羟甲基氨基甲烷    0.7～1.8克 

无水乙醇         800毫升