[发明专利]一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法

说明书

技术领域：

本发明属于现代海洋农业中贝类苗种繁育技术领域，具体涉及一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法。

背景技术：

低温生物学是20世纪50年代发展起来的一门新兴的学科，目前这门学科已经在人、畜等的配子和胚胎的保存方面获得了广泛的应用（常万存等，1998）。虽然超低温冷冻技术在海洋生物中已得到了广泛应用，但是由于某些海洋生物的卵子比较大，且含有大量的卵黄、油滴等，增加了冷冻保存的难度，故这方面的研究集中在海洋生物精子的低温保存研究上（李永仁等，2005）。

目前，低温保存精子技术已经在多种经济鱼、虾、贝类上获得了成功，并得到实际应用。在贝类配子、胚胎的保存上也已经取得了突破性的进展，特别是对于牡蛎早期担轮幼虫的超低温保存技术，已达到商业化的规模（张岩等，2004）。虽然，有个别报道牡蛎幼虫低温短期保存研究（于瑞海等，2006），但尚未见低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的相关报道。

发明内容：

针对于当前香港牡蛎眼点幼虫尚无有效长期保存措施的现状，结合香港牡蛎眼点幼虫耐低温的生物学特性，本发明通过幼虫采集、幼虫冷藏、幼虫管理等技术手段提供了一种利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法。

本发明的利用冰点前临界低温长期保存香港牡蛎眼点幼虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、幼虫冷藏：采集浓缩香港牡蛎眼点幼虫，将其用海水润湿的筛绢网装好扎成包，再用海水润湿的海绵包裹封好，置于0-1℃下冷藏；

b、对步骤a冷藏的眼点幼虫喷洒海水于其海绵上，使其保持湿润；冷藏时间一般可以达到≤90d。

c、幼虫解冻：将步骤b冷藏的眼点幼虫从低温环境中取出，利用常温海水润湿，之后放入容器中，将其搅匀，大约15-20min后，待完全恢复常温后，即获得眼点幼虫。幼虫解冻过程中，90%以上眼点幼虫可以在海水中浮游，处于存活状态。可将解冻后存活的眼点幼虫投入盛有新鲜海水的下好附着基水泥池中采苗。

所述的步骤a的采集浓缩香港牡蛎眼点幼虫是利用80目筛绢网（网孔最大孔径250μm）浓缩香港牡蛎眼点幼虫。

所述的步骤a的海水润湿的筛绢网为500目筛绢网（网孔最大孔径20μm）。

所述的步骤a中采集浓缩的香港牡蛎眼点幼虫，壳高在320-360μm，壳长在270-300μm。

所述的步骤a中将香港牡蛎眼点幼虫用海水润湿的筛绢网装好扎成包，每包眼点幼虫装限制在≤1kg，防止大量幼虫推挤对幼虫自身造成损伤。

所述的步骤b的对步骤a冷藏的眼点幼虫喷洒海水于其海绵上，使其保持湿润，是为了防止眼点幼虫体内脱水，使其处于湿润氛围下的干燥状态，空气湿度维持在100%以上。

所述的步骤b的喷洒海水，其频率为5-7天一次。

在贝类幼虫低温保存技术研究中，李一峰等（2012）公开了《厚壳贻贝早期幼虫低温保存的影响研究》的对比文件1。对比文件1与本发明相比，具有以下不同点，①保存对象不同：对比文件保存的是厚壳贻贝，而本发明保存的是香港牡蛎。②保存阶段不同：对比文件1保存的D形幼虫，即前期面盘幼虫；而本发明保存是眼点幼虫，为面盘后期幼虫。③保存方式不同：对比文件保存时采用的在海水中低密度保存，保存幼虫数量及其有限（≤25个幼虫/mL海水）；而本发明采用的干法保存，可以保存大量幼虫（≥10万个/g）。④保存管理流程不同：对比文件1保存过程中需要投喂饵料，步骤繁琐；而本发明勿需投喂任何饵料。