[发明专利]基因组随机扩增序列SNP多态性及甲基化多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体一种利用基因组随机扩增序列SNP多态性及甲基化多态性(Amplified Fragment SNP and Methylation,AFSM)技术通过混合选择性双酶切扩增、简化基因组复杂度、同时进行甲基化敏感位点区分的基因组随机扩增序列SNP多态性及甲基化多态性的方法。通过在接头处设计96个5碱基序列识别标签，可方便使用Illumina高通量测序技术混合测序后对每个样品进行区分，可高效产出数万SNP位点与甲基化位点，并直接用于全基因组关联分析。

背景技术

利用分子标记进行分子辅助育种可以显著提高育种效率，基于PCR的第二代分子标记目前大量运用于分子育种。现今，以SSR为代表的第二代分子标记的开发和应用需要较长时间，AFLP和DArT分子标记实验中的稳定性较差，等等，由于缺乏多态性高且具有高通量检测技术的分子标记，传统的分子标记都存在着开发时间长，所构建的遗传图谱密度较低。现有的常规标记方法，由于标记密度低，很难找到与数量性状基因关联度密切的位点，这样实际运用分子标记辅助育种面临很大的困难，迫切需要发现和运用高效率的分子标记途径，而SNP代表着第三代的分子标记，在全基因组测序背景下发展起来。目前SNP标记的开发手段和检测手段都因为价格昂贵、操作复杂而无法进行全面推广。

Illumina公司Solexa测序技术于2006年问世，该技术采用边合成边测序的方式（Shendure and Ji,2008；Ansorge,2009；Delseny et al.,2010），其基本原理和步骤是：（1）将待测片段打成几百个碱基（200-500bp）或更短的小片段，然后在小片段两端加上不同的接头用于构建单链DNA文库；（2）利用微注射系统将已经加过接头的待测片断随机添加在特制的芯片（flow cell）上。由于在特制芯片的表面连接有一层单链引物，待测的单链DNA片段可以与芯片表面的引物碱基互补而被固定在芯片上。另外一端（3′或5′）则可以随机地与附近的另外一条引物互补也被固定住，形成一个“桥（bridge）”。（3）在芯片内加入未被标记的dNTP和其它相关试剂起始“桥”形PCR扩增。通过变性，将会释放出刚合成的互补的单链，它们也被锚定到附近的固相表面上。经过不断的PCR循环，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。（4）DNA簇产生之后，扩增子被线性化，加入接头引物、改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，应用边合成边测序的原理进行测序。因为这些dNTP的3′羟基末端带有可化学切割的部分，它们被称为是“可逆终止子”，每个循环只允许掺入一个被荧光标记的dNTP。此时，用特定波长的激光激发结合在dNTP上的荧光标记，释放的荧光被CCD采集，从而读取每条模板序列在第一轮反应所聚合上去的碱基类型。（5）加入化学试剂切割dNTP的3′羟基保护基团，恢复3′端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此反复，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，通过统计每轮收集到的荧光信号，就可以获取每个模板DNA片段的序列信息。

荷兰Keygene公司所拥有的、由Zabean等在1993年发明的AFLP标记是一项将PCR与RFLP结合在一起的技术。AFLP的出现是DNA指纹技术的重大突破，其原理是通过选择性扩增基因组的酶切片段而产生多态性（选择性扩增是通过在引物的末端加上选择性核苷酸而实现），由于AFLP标记多态性丰富，因此具有遗传作图的高效性，另外，AFLP标记所产生的多态性稳定，重复性好，而且它也可用于没有任何分子生物学研究基础的物种，其引物在不同物种之间具有通用性，因此被认为是迄今为止作图效率最高的分子标记。从理论上讲，不论所研究的基因组有多复杂，用AFLP均可以检测出任何DNA之间的多态性。目前，AFLP标记系统己经被迅速应用到棉花等重要作物遗传多样性研究、品种指纹图谱绘制、连锁遗传图构建等多个领域（Donini et al.1997；Wendel et al.1989；Keim et al.1997；Lazo et al.1994；Powell et al.1996；Maquet et al.1999；Mei et al.2003；Lacape et al.2003）等方面得到广泛的应用。