[发明专利]一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的树状半抗原、树状抗原及其应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的树状半抗原、树状抗原及其应用。

背景技术

硝基呋喃类抗生素具有杀菌能力强、抗菌谱广、价格低廉等优点，被广泛应用于临床和动物养殖业。近年来研究表明硝基呋喃类药物及其代谢物对人类具有很大毒性，欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，又在1997年将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物，我国亦于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。由于硝基呋喃类药物代谢速度很快，在生物体内数小时便可降解，而代谢产物可与细胞膜蛋白结合形成稳定结合物，长期存在于生物体内，因而目前对硝基呋喃类药物残留的检测主要集中在对其代谢物含量的测定。3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮（AMOZ）是抗生素呋喃它酮的代谢产物，具有潜在致畸、致癌性，作为非法使用硝基呋喃类抗生素的一种指示物，建立其快速、简单、廉价、有效的检测方法十分必要。   

    目前国内外检测AMOZ的方法主要有色谱方法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。前两种属于仪器分析检测技术，存在着周期长、专业性强、费用高等不足，难以适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析方法具有快速、灵敏、准确等优点，特别适用于现场进行高通量筛选实验。但是，大量实践证明：当化合物（半抗原）的分子量<300 Da时，其高特异性高亲和力的抗体制备难度增大。AMOZ分子量很小（201.22 Da），即使将其与载体蛋白偶联，其高特异性高亲和力抗体的制备难度也相对很大，因而，目前报道的免疫检测方法在检测之前大都需对AMOZ进行衍生化处理作间接检测，存在着前处理操作复杂繁琐、成本高及回收率偏低等不足，限制了其应用，并且，该类免疫检测方法大多停留在酶联免疫吸附分析（ELISA）上，灵敏度较低。

    目前，研究报道的能够对AMOZ进行直接检测的免疫检测方法相对很少。2009年，Pimpitak 等人报道了一种检测强化虾样品中AMOZ残留量的方法。他们将AMOZ与3-羧酸苯甲醛衍生化制备免疫半抗原CPAMOZ，通过抗原制备、动物免疫以及单克隆抗体制备获得单克隆抗体，该抗体虽然能够识别AMOZ，但是识别灵敏度低，比其对半抗原CPAMOZ的灵敏度低23倍。基于该抗体他们建立了间接检测AMOZ的免疫分析方法，即在检测前对其进行衍生化（将AMOZ与2-硝基苯甲醛衍生化为NPAMOZ），衍生化的时间需要十多个小时，十分费时。2012年，Yan等人报道了一种直接检测肉类中AMOZ残留量的免疫分析方法。他们将呋喃环上的硝基氨基化了的呋喃它酮作为免疫半抗原与载体蛋白通过戊二醛偶联制备免疫原，通过动物免疫获得了可以特异性识别AMOZ的多克隆抗体，基于该抗体建立了直接检测肉类中AMOZ残留量的ELISA方法，检测限为0.4ng/g，可用于AMOZ残留量的测定。但是，上述两种方案制备的抗体对AMOZ的父本呋喃它酮均存在严重的交叉现象，并且对呋喃它酮的特异性识别能力要远高于对AMOZ的识别（交叉反应率分别为338%和289%），易导致样品检测结果的假阳性。

在建立小分子化合物免疫分析方法的过程中，半抗原的设计合成是首要并且是关键步骤，半抗原的优劣直接影响到获得的抗体质量。目前采用常规的半抗原制备方案获得的AMOZ抗体均存在特异性差、亲和力低的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统的AMOZ免疫分析技术中均需对其进行衍生化处理的缺陷，提供一种可以用于对呋喃它酮代谢物AMOZ进行直接检测的树状半抗原、人工树状抗原。

    本发明的第二个目的是提供所述AMOZ树状半抗原、人工树状抗原的制备方法。

    本发明的第三个目的是提供一种可以对AMOZ进行直接快速检测的免疫分析方法。

    本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

    一种AMOZ树状半抗原，是通过将AMOZ的乙醛酸衍生物偶联在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到的。所述AMOZ的乙醛酸衍生物具有式（Ⅰ）所示分子结构：

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所述四分支聚酰胺-胺具有式（Ⅱ）所示分子结构：

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所述AMOZ树状半抗原具有式（Ⅲ）所示分子结构：

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