[发明专利]一种荧光素酶‑多抗原融合蛋白以及蛋白A琼脂糖‑融合蛋白‑抗体复合物

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体地说是一种可同时检测四种I型糖尿病自身免疫抗体的方法。

背景技术

一般的，I型糖尿病是一种自体免疫疾病，机体受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素诱发而产生异常自身体液和细胞免疫应答，导致胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少，一旦发病需要依赖外源性胰岛素补充以维持生命，所以I型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病。

此类糖尿病常见于儿童和青年患者，但是它可以在任何年龄段的人群中发生，并且此类糖尿病的患病率约占总糖尿病病例的10%。可见及早地对I型糖尿病进行诊断以及高危人群中进行预报具有重要的意义。

对糖尿病的诊断主要通过检测其自身免疫性抗体，抗体主要包括以下几种：谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、胰岛细胞抗体（ICA）、酪氨酸磷酸酶抗体（IA-2a、IA-2b）及胰岛素自身免疫性抗体(IAA)。目前测定GADA、IA-2A、IAA常用的方法有放射免疫法、酶联免疫法；用于ICA测定的主要用间接免疫荧光法，另外也有用酶联免疫法及免疫组化法。

ELISA技术（enzyme-linked immuno sorbent assay酶联免疫吸附测定）对于酶的活性和灵敏度要求很高，其特异性取决于抗原制备的优劣；且其结合物制备尚未标准化，这使得实验结果的可重复性不高，需要进行多次检测。另外，若抗原及酶结合物浓度低，最后吸光度值太小，易出现假阴性。多数国家的临床检测已放弃ELISA法，使用放射免疫法（RIA法）。

放射免疫分析具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，并且样品用量少，常可测至皮摩尔量。但本方法有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐，有时会影响结果等。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种快速简便、准确率高的，并可同时检测四种I型糖尿病自身免疫抗体的方法。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，该可同时检测四种I型糖尿病自身免疫抗体的方法，其特征在于：将荧光素酶基因与多抗原基因融合成融合载体，所述多抗原采用能够免疫应答产生I型糖尿病的病人血清中自身免疫性抗体的抗原，

然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—多抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-多抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-多抗原融合蛋白稀释液与病人血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物，再加入蛋白A琼脂糖捕捉融合蛋白-抗原-抗体复合物；加入荧光素酶底物，检测荧光强度。

可同时检测四种I型糖尿病自身免疫抗体的方法，包括以下步骤：

A、荧光素酶基因与多抗原基因的融合载体的构建

a、选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列（GAD65抗原基因序列、IA-2a抗原基因序列、IA-2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列），进行PCR扩增，在kpnl位点（GGTACC）引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；

b、将获得的目的片段与PA0815载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；

B、质粒转化

将重组质粒转入制备好的感受态哺乳细胞系统中，在氨苄耐药基因平皿中筛选阳性克隆，从转化细胞内提取质粒DNA，然后质粒DNA进行PCR鉴定及kpnl和xbal双酶切鉴定；

C、融合蛋白的获取

挑取单菌落至含有8%～15% I型糖尿病的病人血清的DMEM培养液中27℃～31℃下培养50～60h，于0～4℃，6000～8000rpm离心15～20min；将得到的细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤并离心2～3次，最后将收获的细胞在冰浴中超声处理15～30 min，然后将细胞裂解液于0～4℃，最大转速离心15～45 min后取上清液；

D、重组融合蛋白的纯化

把步骤C所得上清液，用硫酸铵沉淀法进行分级沉淀，沉淀物经0.05～0.08 mol/L Tris-Hcl缓冲液冲洗2～3次，后冻干备用；

E、将步骤D所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0 PBS磷酸盐缓冲液进行一定倍数的梯度稀释得融合蛋白稀释液，要求融合蛋白稀释液每微升中有10⁷～10⁸个荧光单位；