[发明专利]一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4‑2的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫用抗体制备技术领域，具体涉及一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2及其制备方法以及其在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌，Staphylococcus aureus)属葡萄球菌属，是人类的一种重要病原菌，能够引起肺炎、心内膜炎、烧伤及战伤感染、败血症、中毒性休克等多种严重感染(Lowy FD.New Engl J Med.1998；339，520-532)，它是革兰氏阳性菌脓毒血症的主要致病菌，也是烧伤创面感染、急性肝衰竭的重要病原菌(姚咏明等，脓毒症研究的若干新动态2000；13，517-519)。其能够在人群密集的区域通过飞沫、接触进行大规模传播。更为严重的是，金黄色葡萄球菌耐药性不断增强，如1961年发现的对β-内酰胺类抗生素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，2002年10月又发现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)。2007年10月，Klevens R M等调查表明美国2005年感染MRSA的人数超过9万人，感染MRSA的病人死亡率为19.8％，死亡人数超过HIV感染的死亡人数(Klevens RM，et al.JAMA.2007；298：1763—1771)。更为严重的是，临床已经没有有效的抗生素应对多重耐药的MRSA，抗金黄色葡萄球菌感染亟需新的更有效的治疗策略。

LtaS(LTA合成酶)是金黄色葡萄球菌的细胞膜蛋白之一，全长646aa，N端位于胞内，C端位于胞外，有5个跨膜区，其功能区位于胞外，与金黄色葡萄球菌细胞壁主要成分LTA的合成密切相关。I型多肽酶SpsB可以水解全长LtaS并将其胞外区eLtaS(218-646aa)释放于细菌生长上清中。申请人在实验过程中证实在小鼠急性腹膜炎模型和肺炎模型中eLtaS可以显著加重金黄色葡萄球菌对小鼠的感染，从而证实其为金黄色葡萄球菌重要毒力因子之一；进一步还证实针对eLtaS蛋白的中和性单克隆抗体可以在小鼠腹膜炎模型和肺炎模型中显著减缓金黄色葡萄球菌对小鼠的感染，且证实其抗感染功能的发挥依赖于其对金黄色葡萄球菌LTA合成的抑制。目前关于利用抗细菌毒力蛋白的特异性抗体进行抗细菌感染治疗的研究还未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2。

本发明的目的还在于提供上述单克隆中和性抗体E4-2的制备方法以及其在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

本发明的抗eLtaS的单克隆抗体E4-2的轻、重链蛋白质分子，其可变区氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2所示。该单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7所示。该单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10所示。

上述单克隆抗体E4-2的制备方法，主要内容如下：

1.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建。

首先利用eLtaS蛋白免疫Balb/c小鼠，常规方法进行细胞融合。用ELISA法筛选，阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。

2.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株E4-2的筛选。

通过检测抗eLtaS单克隆抗体对金黄色葡萄球菌LTA合成能力的影响筛选eLtaS中和性抗体。利用脑心浸液培养基常规条件培养金黄色葡萄球菌，分别在培养体系中加入抗eLtaS单克隆抗体及对照IgG至100μg/ml，继续培养6小时后收集细菌，利用玻璃珠研磨获得细菌细胞壁LTA，SDS-PAGE分离所获LTA并转移至PVDF膜，使用LTA特异性抗体检测不同处理条件下细菌LTA水平。结果表明抗eLtaS单克隆抗体E4-2可以有效抑制金黄色葡萄球菌LTA合成。

3.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株E4-2的鉴定。

用双相琼脂扩散实验证明E4-2杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。

4.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株E4-2的亲和力和特异性检测