[发明专利]一种兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法

说明书

技术领域

本发明涉及兔体外单层肝细胞系模型建立方法，以及将其传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法，属于肝细胞体外培养技术领域。

背景技术

兔球虫是家兔最常见的一种寄生虫，对养兔业危害极大，幼兔感染率高达90％以上，死亡率高达40-70％，除兔斯氏艾美尔/肝球虫斯氏艾美尔球虫独立寄生于兔肝胆管上皮细胞外，其余13种都寄生于肠。各类球虫免疫没有交叉保护性，肠球虫可以通过粪便收集提纯而获得虫株，然后进行疫苗的研制，但肝球虫的虫株病料不易收集，只能在兔子屠宰后从内脏中收集，这样使得肝球虫虫株提纯收集及繁殖受到极大地限制，从而影响疾病的诊断及治疗。目前，国内外对斯氏艾美尔球虫即兔肝球虫的研究不多，对它造成的危害性也没有引起足够的重视，实用性的研究成果基本上处于零的状态。

如果能够建立兔体外单层肝细胞系模型，并得到肝细胞株的连续传代培养及储存方法，就可以模拟兔斯氏艾美尔/肝球虫体内生长循环模式，进而达到体外获得极难取得的病源——具有无限繁殖能力的球虫虫株的目的。目前通过杀兔取肝得到球虫虫株，获得的球虫虫株数量有限且试验成本很高，遏制了兔肝球虫疫苗的研究。因此体外培养兔肝细胞并获得球虫虫株，不仅可以减少对兔子的杀戮，带来动物福利；还可以降低成本，减少购买兔子的费用，最重要的是为解决兔肝球虫疫苗虫株的大量生产奠定了基础，为广大兔养殖户带来更高的经济效益。

但是兔肝原代细胞的培养难度很大，特别是单层细胞的培养。在产品方面，2013年才从网上查到有一家公司在出售兔肝细胞，但经咨询后为悬浮细胞，没有贴壁细胞，且据说仅能传代10代左右。在理论方面，虽然有论文发表，但依据其提供的方法并不能培养成功，同时细胞培养所需的环境及技术要求较高，原代细胞培养成功后，大部分的报道不能超过3代进行传代。国内文献参考了《乳兔和成年兔肝细胞体外分离及培养的比较研究》，国外文献参考了《Identification of Carbohydrates on Eimeria stiedai Sporozoites and Their Role in Invasion of Cultured Cells in vitro. Department of Veterinary Physiology》（Research Center for Molecular Protozoology, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Obihiro 080, Japan）。 但按其参考文献的流程程序，均未能培养出单层肝细胞，尤其是在应用胰酶、胶原酶消化的浓度和时间方面的数据，与发明人的试验数据具有较大出入。同时文献中提到的乳兔肝细胞仅仅能传代4代、成年兔为2代，不可能培养出连续性的肝细胞株。

发明内容

本发明旨在寻求一种可以替换代价昂贵的应用动物实验繁殖兔肝球虫（斯氏艾美尔球虫）病原收集的方法，通过兔体外单层肝细胞系模型建立及传代为连续性肝细胞株的培养及储存方法体外建立，能够稳定的实现兔体外肝细胞的快速、便捷、经济的传代，以便能够在后续实验中实现体外繁殖球虫病原的目的。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种兔体外单层肝细胞系模型建立方法，包括如下步骤：

a、兔子肝脏的获取：将兔子击昏脑部致死后，置于消毒液中0.5-2分钟后取出，沥净消毒液后，无菌取出兔子的肝脏放入培养皿中；一般兔子的击杀方式为颈静脉放血致死和颈动脉放血致死，这两种方式在实验过程中均不能得到贴壁肝细胞，经过研究人员的缜密探讨和大胆尝试，最终确定了击打兔子后脑的不放血击杀方式，且击杀兔子后应尽快获取肝细胞；

b、兔子肝脏的预处理：将兔子肝脏在培养皿中用平衡盐溶液洗净血液后，更换新的平衡盐溶液，将兔子肝脏边剪碎边用平衡盐溶液清洗，将兔子肝脏剪成约1mm³的碎块；剪碎过程中应当将血管、胆管等肥肝组织剔除；

c、消化得到分散兔子肝细胞：将剪碎的兔子肝细胞放入珠瓶中，震荡打散，然后加入消化液，将珠瓶放入37℃的恒温水浴箱中消化8~15分钟；所述消化液为0.025%胰酶；此处所述珠瓶为盛有玻璃微珠的三角瓶，玻璃微珠占三角瓶体积的1/4左右；吹打分散的方法不能够很好的适用于本发明，采用珠瓶，利用震荡时玻璃微珠之间及其与瓶壁纸件的摩擦和碰撞，能够很好的对剪碎的肝组织进行分散；

d、收集细胞悬液：取出珠瓶，加入DMEM液充分震荡至溶液浑浊，经4-6层纱布过滤到小烧杯内，重复收集步骤4-5次，得到含有消化好的兔子肝细胞的悬液；