[发明专利]水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法和双向电泳分离方法

权利要求书

1.一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）用体积浓度75%酒精消毒水牛阴囊皮肤，切开阴囊并剥离其周围组织，取出睾丸，置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室；用PBS反复冲洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小块睾丸实质，用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中；

（2）向步骤（1）的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液，使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10，置于37℃摇床上震摇2～3h，直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃，轻轻倒掉上清液，用PBS溶液冲洗2～3次，将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中；

（3）向步骤（2）的1.5mL离心管中加入纯化的曲精细管样品3～5倍体积的蛋白裂解液，冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解，4℃、12000g离心10min，收集上清液；（4）向步骤（3）收集的上清液中加入4倍预冷丙酮，-20℃静置2～3h或过夜，4℃、12000g离心30min，弃上清，再用预冷丙酮洗涤沉淀2～3次，室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发，蛋白沉淀用水化液复溶，Bradford法测定蛋白质浓度，-80℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）的混合酶溶液按以下步骤配制：将胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ用PBS进行溶解分别制成浓度1mg/mL和300μg/mL的溶液，然后按照体积比10:3混合，即得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（3）的蛋白裂解液组成为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS和1%DTT。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（4）的水化液的组成为8mol/L尿素和2%CHAPS。

5.用于权利要求1所述水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法，其特征在于包括以下步骤：

（5）取步骤（4）中得到的蛋白质样品350μg，选取24cm、pH4～7的IPG胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦，在蛋白质样品中加入2.25μL IPG Buffer和0.01g DTT，并根据蛋白质样品上样体积加入适量水化液使上样总体积达到450μL；

（6）将步骤（5）中混合均匀的450μL上样溶液缓慢加入胶条槽中，IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混合液，避免产生气泡，最后加入2～3mL Immobiline DryStrip矿物油覆盖防止溶液挥发，盖上盖子水平放置于聚焦仪上进行等电聚焦；

（7）将步骤（6）中等电聚焦后的IPG胶条放入15mL平衡液I中，于摇床上平衡15min，再使用等体积的平衡液II平衡15min；

（8）将步骤（7）中平衡好的胶条转移至12.5%的SDS-PAGE凝胶顶端进行第二向垂直电泳，以恒流15mA/gel电泳15min后，增大电流至25mA/gel，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部停止电泳。

6.根据权利要求5所述的双向电泳分离方法，其特征在于还包括以下步骤：

（9）步骤（8）中第二向SDS-PAGE电泳结束后，取出玻璃板，将凝胶剥离后进行硝酸银染色，染色结束后，使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶并将图像保存，应用Image Master2D platinum软件分析图像。

7.根据权利要求6所述的双向电泳分离方法，其特征在于步骤（5）的水化液的组成为8mol/L尿素和2%CHAPS。

8.根据权利要求7所述的双向电泳分离方法，其特征在于步骤（6）中等电聚焦按以下程序进行：30V，6h、60V，6h、200V，1h、500V，1h、1000V，1h、8000V，1h、80000Vhs，10h、1000V，10h。

9.根据权利要求8所述的双向电泳分离方法，其特征在于步骤（7）中平衡液I的的组成为6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，1%DTT；平衡液II的组成为6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，4%IAA。