[发明专利]水牛产奶性状MC4R基因的克隆及作为分子标记的应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及水牛产奶性状MC4R基因的克隆及作为分子标记的应用。 

背景技术

水牛是我国南方特有的种畜资源，而较低的产奶量和繁殖性能已成为了影响其产业发展的两大科学问题。显然，利用先进的分子标记技术应用于优良奶水牛种质资源的选育将会有效的提高选种效率。 

产奶性状是奶水牛的一个重要经济性状，由多种微效基因决定，是一种典型的由多基因控制的数量性状。克隆奶水牛泌乳性能相关基因并探讨其遗传特性，以提高奶水牛生产性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。 

黑素皮质素受体(Melanoeortin Receptors,MCRs)家族是目前所知的最小的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)亚家族，它们均属于A类7个跨膜α螺旋G蛋白受体，是一系列小基因的产物。到目前为止，共有5个黑素皮质素受体基因(MC1R-MC5R)被克隆、鉴定和定位，其中MC3R和MC4R在控制食欲和体重稳态中具有重要作用，且MC4R在动物体重、采食量和能量稳态的控制中具有重要作用，在人、猪和马等哺乳动物中主要影响机体脂肪、增重、采食等性状（仇雪梅等,2002）。根据MC4R基因功能，该基因可作 为影响水牛产奶性状的候选基因，用于分子标记的开发和利用，为建立分子标记辅助选择技术奠定基础。 

迄今为止，尚无有关水牛MC4R基因作为水牛产奶性状的分子标记。 

发明内容

本发明的目的在于围绕我国水牛品种产奶量较低的问题，提供水牛产奶性状MC4R基因的克隆及作为分子标记的应用。通过克隆获得水牛产奶性状相关基因MC4R，对该基因进行多态性分析，为水牛的标记辅助选择提供分子标记。 

本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 

1.水牛产奶性状基因MC4R作为分子标记，所述MC4R基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。 

2.SEQ ID NO：1第226bp处C226-T226的碱基突变，与水牛产奶量极显著相关（p<0.01），第1104bp处的C1104-T1104和1525bp处的A1525-G1525碱基突变，与水牛产奶量显著相关（p<0.05）。 

3.本发明水牛产奶性状相关基因MC4R获取的具体步骤如下： 

（1）利用RNAiso试剂盒（Takara，Daliang，China）从成年的水牛脂肪组织中提取总RNA,并进行质控以及于-20℃保存。 

（2）根据已报道的牛MC4R基因序列（GenBank:FJ430565.1），利用Primer5.0引物设计软件，经Oligo软件检测，确定引物，并委托大连宝生物技术有限公司合成。其中用于扩增所述基因的正反向引物的DNA序列如下所示： 

正向引物： 

5‘-GCTCGACGGAGAAGAAGCAT-3’； 

5‘-GGCCATGAGGAACATGTGGA-3’； 

5‘-TTGCCCAGTCTCGGTGTATT-3’； 

反向引物： 

5‘-CTGCCTCATCACCGTGTTCT-3’； 

5‘-AGACTGGGCACTGTTTCACA-3’； 

5‘-CAACTTCTGCACAGGAAGAATGA-3’； 

并委托大连宝生物技术有限公司合成。 

3.将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果；将扩增产物克隆至pMD-18T，挑取阳性克隆委托深圳华大科技有限公司测序，结合生物信息学分析获取水牛MC4R基因核苷酸序列。 

4.本发明水牛产奶性状相关基因MC4R作为分子标记的应用，具体步骤如下： 

（1）对待选育水牛进行静脉采取提取总DNA；根据水牛家族系谱和产奶记录，选取5头高产水牛（≥2000kg/泌乳期）和5头低产水牛（≤1000kg/泌乳期），用于下一步骤水牛MC4R基因SNP位点的筛选； 

（2）根据水牛MC4R基因序列，利用SEQ ID NO:2～7所示的引物，对上述10头水牛DNA样品进行PCR扩增，取5μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余样品送至深圳华大科技有限公司测序。 

（3）利用DNAStar7.0Seqman生物信息分析软件对测序结果进行比对，获取候选的SNP位点。