[发明专利]一种RNAi干扰片段、RNAi干扰载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于调控绵羊发情与产羔相关性抑制素βA RNAi干扰片段、RNAi干扰载体及RNAi干扰载体的制备方法。

背景技术

新疆作为我国五大牧区之一，是拥有绵羊品种较多。绵羊季节性发情、排卵以及产羔的这种繁殖性状导致了较长的世代间隔，使其利用率较低，是新疆绵羊工厂化，集约化养殖的主要难题之一。

现有研究主要是选择与绵羊季节性生理变化密切相关的下丘脑-垂体-性腺轴上激素相关基因及卵巢内各种调节因子，如褪黑激素受体、抑制素基因、催乳素受体基因等进行相关性分析。为了进一步探讨绵羊季节性繁殖性状和发情性状，筛选与绵羊发情性状相关的调控基因，本发明在前期研究中采用抑制性消减杂交的方法，选择常年发情的湖羊，季节性发情的中国美利奴羊，构建了湖羊和中国美利奴绵羊卵巢组织的消减cDNA文库，成功筛选并确定抑制素βA为非季节繁殖的差异基因，本发明则是利用抑制素βA通过RNAi的方法探讨该基因对发情性状的影响。

RNA干扰是通过内源的或人工方法使小片段RNA在细胞内引起与之同源互补mRNA的降解，并致使基因沉默的一种现象，最终阻止目的基因表达的有效手段之一。它以其序列特异性、高效性、选择性和稳定性等优点，被广泛应用与基因功能、疾病治疗以及修复遗传损伤等方面的研究。

抑制素是一种作用于下丘脑-垂体-性腺的重要调节激素，它的生理学作用就是选择性的抑制垂体合成和分泌FSH，从而影响动物卵巢、卵泡的生长发育以及产仔数。自上世纪30年代左右，国内外研究者就利用各种方法对动物的多胎性状进行研究，而抑制素这种即具有免疫原性，同时又与卵巢功能密切相关的基因也就顺利的成为了学者的研究目标。Morris等研究表明，用抑制素主动免疫母牛，可显著提高双犊率。2006年，崔先利等用抑制素质粒免疫黄牛，结果发现免疫组成熟卵泡个数比未处理组个数多显著多0.54个(P<0.05)。免疫组诱发牛排双卵率60.71%(51/84),也显著高于对照组13.75%(P<0.05)。曹晓涵、王振华等采用新疆细毛羊抑制素成熟区序列重组融合蛋白免疫小鼠，结果显示处理组产生了很高的抗抑制素抗体滴度，且极显著的提高了FSH的含量，促进了大鼠卵巢发育，增加了成熟以及优势卵泡的数量。

国内外已有的研究证明，抑制素βA基因与动物的产仔数有显著影响，而该基因在自分泌和旁分泌的形式来调节卵泡的生长发育以及排卵的同时也促进了动物卵巢的发育。本发明以抑制素βA基因作为候选基因，以RNAi技术为基础，通过卵巢直接注射抑制素βARNAi载体的方法，研究该基因对绵羊的发情性状的影响。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种用于干扰绵羊卵巢颗粒细胞中抑制素βA基因的RNAi干扰片段、RNAi干扰载体及其构建方法。本发明提供的RNAi干扰片段及RNAi干扰载体可以使绵羊卵巢颗粒细胞中抑制素βA基因进行沉默，从而促进动物发情、繁殖，解决了绵羊非繁殖季节不发情、不产羔的繁殖问题。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种RNAi干扰片段，用于干扰动物卵巢颗粒细胞中的抑制素βA基因，所述RNAi干扰片段的序列为TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT或CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA或GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA或CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。

进一步地，所述RNAi干扰片段作为制备干扰动物卵巢颗粒细胞中抑制素βA基因的药物的应用。

本发明还提供一种用于干扰动物卵巢颗粒细胞中的抑制素βA基因，所述RNAi干扰载体具有RNAi干扰片段；所述RNAi干扰片段的序列为：TGCCCTTGCT TTGGC TGAGA GGATT或CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA或GCTGC ACTTTGAGAT TTCCC AAGAA或CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。

进一步地，所述RNAi干扰载体包括PLLU2G载体，所述PLLU2G载体与所述RNAi干扰片段连接。

进一步地，所述RNAi干扰载体在促进动物繁殖中的应用。

进一步地，所述RNAi干扰载体以卵巢直接注射、静脉注射及肌肉注射中的一种方式注射至动物体内，用于促进动物繁殖。

本发明另一方面还提供一种RNAi干扰载体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：