[发明专利]一种基于微流控芯片的农药残留检测方法

权利要求书

1.一种基于微流控芯片的农药残留检测方法，其特征在于，该传感器的组装过程为：将蛋白A通入微流控芯片中，蛋白A和金原子紧密结合，且与农药抗体的Fc端结合而使其定向固定；再将毒死蜱抗体通入微流控芯片中；最后，利用抗原抗体间的特异性反应，通入不同浓度的农药，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗后进行阻抗检测，进而制备出了一种新型的农药残留免疫传感器；

根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述农药分子为毒死蜱农药。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，使用的微流控芯片由一块一面溅射有三对插指金电极的玻璃平板和另一块具有微通道构型的玻璃封接平板叠合而成；叉指电极的两端由两根引线引出，两个平板中间形成封闭通道,在其中一块平板上设置有通道的进出口，微流体通道（深40 μm，宽100 μm）与微流体检测室（宽500 μm，长1723 μm；容积为34.5 nL）由聚二甲基硅氧烷（PDMS）模设计而成，金插指电极由3对阵列电极组成,相互交叉在一起。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，抗体在微流控芯片上的固定步骤如下：

1） 清洗并测试微流控芯片；

2） 将步骤1）所得微流控芯片进行流量、外加电压、液体通入时间等参数，进行优化；

3） 将步骤2）所得的微流控芯片中，在最优条件下通入蛋白A，获得蛋白A修饰界面；

4） 在步骤3）所得蛋白A修饰芯片中通入抗体，获得抗体修饰界面；

根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1）所述清洗并测试微流控芯片，是分别通入一定量的氢氧化钠、氯化氢等一段时间，再通入双蒸水，冲洗干净；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2）所述流量、外加电压等参数进行了优化：流量选取在5-35 μL/min；外加电压选取在10-100 mV；液体通入时间1-10 min。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）所述通入蛋白A溶液，通入的流量为10 μL/min，固定90 min。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4）所述通入毒死蜱抗体，通入的流量为10 μL/min，固定2 h，孵育温度为4 °C。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，检测方法建立具体步骤如下：

1） 微流控芯片的清洗：首先通入0.1 M氢氧化钠，静止1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；再通入0.1 M氯化氢，静止1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；整个试验清洗中的通速都采用10 μL/min；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗，如有需要，可以通过显微镜观察微流控中金插指微阵列电极的表面状态，（清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法）；

2） 取蛋白A原液（1 mg/mL），用PBS稀释不同倍数，配置10、100、200 μg/mL等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值，通入蛋白A溶液的流量为10 μL/min，固定90 min；

3） 取毒死蜱抗体原液（1 mg/mL），用PBS稀释不同倍数，配置10、100、200 μg/mL等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值100 μg/mL，通入毒死蜱抗体的流量为10 μL/min，固定2 h，孵育温度为4 °C；

4） 通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μL/min，用PBS冲洗后进行阻抗检测，建立毒死蜱浓度与阻抗变化之间的标准曲线，在1-1.0×10⁴ ng/mL范围内线性范围良好，线性回归方程分别为：y=65.580 lgC (ng/mL) + 9.8400 (线性相关系数R²=0.9868)。

8.根据权利要求1所述方法，果蔬中农药残留具体检测步骤如下：

1）果蔬样品预处理方法如下：选取蔬菜或水果样品，用潮湿的抹布将蔬菜表面的泥土擦拭干净，切碎成3×3 mm，取样品2 g，放入提取瓶中，加入10 mL磷酸盐缓冲液，放入超声提取仪，超声提取3 min，倒出提取液静置2 min，备用；

2）在微流控芯片上固定抗体后，用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测，利用得到的阻抗图谱中的bode图，获取所测阻抗值Z₁；

3）加入果蔬样品液后，微流控芯片用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测，利用得到的阻抗图谱中的bode图，获取所测阻抗值Z₂；

4）计算农药测试前后的阻抗变化ΔZ=Z₂-Z₁，根据阻抗变化与毒死蜱浓度的关系曲线获得果蔬实际样品农药浓度的信息。