[发明专利]miR-146a-5p在非小细胞肺癌细胞系中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种miR-146a-5p在非小细胞肺癌细胞系中的应用。

背景技术

微RNA（microRNA, miRNA）是真核生物中广泛存在的一种长约18到25个核苷酸（nucleotide）的RNA分子，它们在维持正常细胞的功能方面起到重要的作用。miRNA的表达异常会导致包括肺癌，肝癌，肉瘤等癌症在内的许多疾病的发生。研究发现，miRNA能在转录后水平调节其靶基因的表达，一般都是和靶基因3?-UTR或者5’-UTR直接结合，它们在人类癌症的发病机理和预测中都有所涉及。值得注意的是，miRNA在血清中也稳定的存在，表明它们具有作为癌症生物标记的潜在可能性。

肺癌是所有肿瘤中发病率、死亡率最高的肿瘤。我国每年新发肺癌患者70万人，其中三分之二的患者初诊时已失去手术机会。根据癌细胞的显微镜下组织学上的大小和外观，肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中，非小细胞肺癌占据了80%~85%之多。目前，miRNA在肺癌中的功能调控已成为研究的热点。经过对已报导文献的总结及在几株非小细胞肺癌细胞系中的含量检测，发现miR-146a-5p的表达量相比正常分肺组织细胞明显降低，显示了其潜在的抑癌作用。另外miR-146a-5p在肺癌细胞周期，甲基化过程以及细胞增殖过程中起到重要的调控作用，并且参与到多功能转录因子调控网络中，成为非小细胞肺癌细胞系重要的调控因子。

发明内容

本发明的目的之一在于提供miR-146a-5p在制备抑制非小细胞肺癌细胞系H1299细胞增殖药物中的应用。

本发明的目的之二在于提供miR-146a-5p在制备抑制非小细胞肺癌细胞系Spca-1细胞增殖药物中的应用。

本发明的目的之三在于提供miR-146a-5p在制备抑制非小细胞肺癌细胞系H1299细胞G1/S转化药物中的应用。

1）  通过qRT-PCR手段，在正常的肺组织细胞系Beas-2B和不同的非小细胞肺癌细胞系H1299、Spca-1、H23、95-D、HCC827、A549中，检测miR-146a-5p的表达量变化。发现，miR-146a-5p在Hcc827中的表达量最高，并且高于正常的肺组织细胞系Beas-2B。在其余细胞系中的表达量，均低于正常的肺组织细胞系Beas-2B一半以上。另外检测了31组人肺癌组织样本与相应的癌旁组织，发现有20组样本中肺癌组织miR-146a-5p表达量明显低于癌旁组织。

2）  将miR-146a-5p过表达后，检测H1299、Spca-1细胞增殖和细胞周期的变化。在H1299、Spca-1细胞中转染miR-146a-5p的mimics，通过CCK8和流式细胞周期分析手段发现，miR-146a-5p抑制H1299、Spca-1的细胞增殖，同时抑制H1299细胞G1/S转化，把细胞阻滞在G1期。

3）  通过STARBASE（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测，Ccnd1、Ccnd2的3′-UTR中有miR-146a-5p序列的结合位点。将Ccnd1、Ccnd2野生型3′-UTR以及含有种子序列突变的3′-UTR构建到pGL-3报告基因的下游，通过双荧光素酶报告分析，发现带有Ccnd1、Ccnd2野生型3′-UTR报告基因受到miR-146a-5p调控，而突变型不受miR-146a-5p调节。

4）  在H1299细胞中过表达miR-146a-5p，western blotting结果证明Ccnd1、Ccnd2受到miR-146a-5p的下调。上述结果证实，Ccnd1、Ccnd2是miR-146a-5p的靶基因。

综上所述，miR-146a-5p在非小细胞肺癌细胞系H1299、Spca-1、H23、95-D、A549中特异低表达。通过实验证明，过表达miR-146a-5p能够抑制细胞增殖，并抑制细胞周期中G1/S期转化。同时，过表达miR-146a-5p在western blotting等实验中验证Ccnd1、Ccnd2基因为miR-146a-5p的靶基因。本实验首次证实Ccnd1、Ccnd1基因为miR-146a-5p的靶基因，该发现对肺癌发生机制研究及发展做出一定贡献。

附图说明

图1为miR-146a-5p在Beas-2B、H1299、Spca-1、H23、95-D、Hcc827、A549  细胞中的表达量。