[发明专利]基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种网状滚环扩增体系及其应用，特别是一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用，实现DNA的高效扩增和信号放大，并对超低浓度的靶标DNA进行检测。

发明背景

随着基因检测与研究的不断升温,各种相应的分子生物学技术不断涌现。要实现基因的快速灵敏检测，需要针对其物质基础即核酸发展相应的检测方法。现有的微量核酸检测主要依赖于核酸扩增技术，这一分子生物学领域的常用技术。聚合酶链反应（PCR）是目前使用最为广泛的DNA扩增技术, 不仅可以扩增和分离目的基因, 在临床诊断、基因突变检测、法医鉴定等方面也有重要用途。然而,常规PCR 技术也存在一定缺陷：（1）在应用上依赖于高质量的热循环仪，因此难以在基层推广应用；（2）多因素影响扩增效果；（3）常引起非特异性扩增；（4）扩增反应时间长等，急需更新的方法来替代。

自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的核酸恒温扩增技术。滚环扩增技术（RCA）是其中最典型的之一。滚环扩增技术是1998年建立的通过借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而建立的一种可在恒温下发生的核酸扩增技术。在第一代线性滚环扩增反应（LRCA）中，当有环形DNA模板、引物、dNTP、以及聚合酶时，通过DNA 聚合酶的作用，以环形DNA为模板进行复制，引物被延伸并最后形成了一条与环形DNA模板互补的具有重复序列的线状DNA单链，该技术具有快速、灵敏、特异的特点。

 1998年Lizardi等在第一代线性滚环扩增基础上建立了第二代超分支滚环扩增（HRCA）技术。它通过增加一条与环形DNA部分序列相同的通用引物序列，与线性滚环扩增的产物结合，在DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物，被置换的延伸产物又可以作为互补模板由环形DNA的滚环扩增的起始引物进行延伸，从而得到更多拷贝的扩增产物。与线性滚环扩增技术相比,超分支滚环扩增技术具有更高的灵敏度。

随着人们对检测分析的需求进一步加大和提高，以及一些超低丰度的核酸物质如小RNA等逐渐成为重要的分子标记物，这对核酸扩增技术提出了更高的要求。发展更快速，更特异，更灵敏以及更节约成本的核酸扩增技术成为科研工作者关注的焦点问题，也是研究新型核酸扩增模式亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系。

本发明的目的之二在于提供该网状滚环扩增体系的扩增方法。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：在超分支滚环扩增反应体系中加入切刻内切酶Nb.BsrDI，它通过识别DNA双链特定的核苷酸序列，在特定位点切割双链中的一条单链，这些切割下来的单链与环形DNA模板部分互补并可以充当引物，在DNA聚合酶和dNTP存在下，继续诱发超分支滚环扩增反应，从而大幅提高扩增效率（附图 1）。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系，其特征在于 该网状滚环扩增体系中有组成及浓度为：

环状DNA模板                                                      100 nM；

靶标DNA                                                             1 μM；

引物                                                                    1 μM；

dNTP                                                                    400 μM；

Bst DNA聚合酶大片段                                       8 U；

切刻内切酶Nb. BsrDI                                         10 U；

1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液                        v/v；

所述的环状DNA模板是包含了三部分序列的环状碱基序列，第一部分是与标靶DNA序列互补的序列；第二部分是包含有切刻内切酶Nb. BsrDI的识别位点的所述的引物的序列相同的碱基序列；第三部分是随机序列，用于将第一部分序列与第二部分序列进行连接；