[发明专利]一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物制备技术领域，更具体地，涉及一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，其菌体呈杆状，菌落表面粗糙不透明，污白色或微带黄色。枯草芽孢杆菌能形成芽孢，是重要的工业酶制剂的生产菌，它可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等，另外，枯草芽孢杆菌的菌体可直接用于生物农药，因此具有广泛的应用范围和应用价值。

芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，枯草芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保存，复活率高，是制备枯草芽孢杆菌制剂的理想存在形式，而制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因素，芽孢的形成受环境因素的影响，不同菌种形成芽孢的条件不同。 

目前国内众多发酵（芽孢杆菌微生物制剂类）企业的产品存在发酵生产菌芽孢含量较低的问题，一般只有10～50×10⁷CFU/g，大大影响了产品的成本及质量。为此，采取措施提高芽孢杆菌产品发酵生产的芽孢含量、保持产品使用过程中菌体的高活性是十分必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中芽孢杆菌微生物制剂类产品中芽孢含量低的缺陷，提供一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的活性高、芽孢含量高的枯草芽孢杆菌产品。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

本发明提供一种高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法，所述方法是将枯草芽孢杆菌原始出发菌株经复活和扩大培养后，接种并转入发酵培养基中，在发酵的特定阶段，向发酵液中加入特定配方组成的无机盐溶液，该无机盐溶液可以提高芽孢杆菌的出芽率；所述枯草芽孢杆菌原始出发菌种（Bacillus subtilis）可采用市购的枯草芽孢杆菌产品。

所述高效提高枯草芽孢杆菌出芽率的方法包括以下步骤：

S1. 原始出发菌株经复活，扩大培养得到发酵菌液；

S2. 往S1所得发酵菌液中添加甘油作为发酵菌种，保存备用；

S3. 将S2所述发酵菌种接入发酵培养基，在发酵过程中添加无机盐溶液，所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.12～0.125% MgSO₄·7H₂O、0.01～0.015% MnSO₄·H₂O、0.05～0.1% CaCl₂、0.005～0.008% FeSO₄·7H₂O、0.015～0.02% KI、0.035～0.04% KH₂PO₄，最后调pH值为6.8～7.2。

作为一种优选方式，S3所述无机盐溶液含以下重量百分比的各组分：0.122% MgSO₄·7H₂O，0.012% MnSO₄·H₂O，0.056% CaCl₂，0.007% FeSO₄·7H₂O，0.018% KI，0.037% KH₂PO₄，最后调pH值为7.0。

其中，Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、I^-、K⁺、P⁵⁺配合在一起能够有效促进细菌营养体向芽孢这种休眠体转化。细菌营养体当遇到逆境时，它自我保护产生芽孢，而无机盐以某种形式配合起来，却能起到为细菌营养体提供一个逆境的环境，促进芽孢的生成。

优选地，S3中所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的5～10%。

最优选地，S3中所述无机盐溶液的添加量为发酵液体积百分数的8.5%。

具体地，S1所述原始出发菌株的复活和扩大培养包括以下步骤：

S11. 从原始出发菌种中挑取一环菌体，接种到种子固体平板培养基上，划线分离，于36～37℃培养12～16h培养得单细胞菌落；所述种子固体平板培养基是在菌种液体培养基中加入1.5～2% 琼酯倒入无菌平板中制成；