[发明专利]一种分离真盐生植物内生细菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物学领域，涉及一种从真盐生植物中全面分离获得内生细菌的方法。背景技术

植物内生细菌与宿主在长期共同进化中形成和谐联合关系。生长在高盐、冰冻等极端环境中的植物，其体内存在具有特殊功能的内生细菌类群。盐生植物作为盐渍环境中唯一能生存的植物，其内生细菌的研究正成为生物、医药、环境等领域的热点。

现有所公布的植物内生菌分离方法200710065724、200810107514主要分为四步，第一步先将植物清洗后剪切成1-2cm小片段，第二步把植物小片段放入消毒液浸泡进行消毒，第三步通过人工研磨或组织捣碎机破裂植物小片段，结合离心的方法将内生菌从植物组织匀浆中分离，第四步将含有内生细菌的液体和稀释液涂布于常规细菌培养基，在28℃-30℃下培养。

然而，这些常规步骤存在三方面缺点：其一，植物组织尤其是根和茎含有多种细微管道，在消毒过程中消毒液会浸入植物片段的两端导致内生细菌死亡，这些部分作为分离源从开始就减少了内生细菌的数量和种类；其二，人工研磨和费用高昂的组织捣碎机均无法快速将木质化程度高的植物组织充分破碎，并且离心只是通过离心力将植物组织碎片沉淀，不能将附着在碎片内的细菌剥离，从而造成很多内生细菌仍然存在植物组织中；其三，内生细菌与宿主长期共同进化，适应宿主植物体内的物质环境，极端环境中的植物具有特殊的植物内环境，其内生细菌也与普通植物内生细菌不同，常规培养基并不适合全面分离特殊植物内生细菌从而降低分离得到的数量和种类，加上温度28-30℃培养会造成优势菌群快速生长繁殖形成大菌落，无法观测到劣势菌群和低温生长菌群，加剧最终内生细菌数量和种类丰度偏差。

盐生植物有别于普通植物，多分布于沿海和干旱区盐碱地。真盐生植物(euhalophyte)作为盐生植物中最抗盐的一类，其结构更为特殊。真盐生植物茎部和根部高度木质化，叶部多形成同化枝，含有大量导管和筛管，并且真盐生植物通过离子区隔化将盐分局限于液泡和老叶中，体内含有高于普通植物的盐分以及多种已知和未知的抗逆境性物质。正是因为真盐生植物结构和内环境的特殊性，采用常规分离方法因植物小片段消毒损失部分内生细菌，并且真盐生植物同化枝，茎和根的木质部破碎不完全，加之离心造成部分细菌未被从组织分离出来，以及培养条件尤其是常规培养基物质成分不合适，导致真盐生植物内生细菌的数量和种类显著减少。

发明内容

本发明目的在于，提供一种分离获得真盐生植物内生细菌的方法，该方法是由配制培养基、植物预处理、表面消毒、二次剪切和破碎、内生细菌的分离和培养过程步骤完成，将真盐生植物表面消毒、二次剪切选取最佳部位后机械破碎真盐生植物组织，涡旋高速震荡分离内生细菌，通过特殊培养基低温培养内生细菌。本发明与现有方法相比，不仅可利用费用低廉的机器快速破碎真盐生植物组织，涡旋震荡使真盐生植物组织中的内生细菌释放更加充分，而且通过特殊培养条件提高得率，从而在种类和数量上均获得更好的真盐生植物内生细菌分离效果，以期尽可能获得真盐生植物体内所有的内生细菌，克服已有技术中的局限性。

本发明所述的一种分离真盐生植物内生细菌的方法，按下列步骤进行：

a、配制培养基：取5-15克真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织为同化枝、茎和根，剪碎后在100mL水中煮沸10-30min，温度95-100℃，再将煮沸液通过3-4层纱布过滤，收集滤液，用10-20mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1-2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入滤液中使总体积为100mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基＝1∶10混合，温度121℃灭菌15-20min后，制成平板；

b、植物预处理：将真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织经超声清洗后，切成4-6cm片段；

c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒3-3.5min，再用体积分数为75％乙醇溶液浸泡消毒3-3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；

d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5-1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5-1cm小段，放入温度0-4℃预冷处理30min-60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为2-5片，功率为300W-350W的搅拌机充分打碎；