[发明专利]一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗，其特征在于该疫苗抗原含有SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗，其特征在于所述的疫苗为含有SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列的重组质粒pETDnaK转化大肠杆菌BL21(DE3)中获得的重组蛋白。

3.如权利要求1或2所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）热激蛋白基因的克隆：以嗜水气单胞菌基因组DNA为模板，使用AH DnaK F1和AH DnaK R1为引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化后与载体pEASY-Simple-T1室温连接10分钟，将混合液转化至大肠杆菌DH5α中，在含有100μg /ml氨苄青霉素、40μg/ml X-Gal和24μg/ml异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的LB固体培养基上培养16小时后筛选阳性克隆，获得重组质粒pEASYDnaK，所述的引物AH DnaK F1序列如SEQ ID No.2所示，所述的引物AH DnaK R1序列如SEQ ID No.3所示；

2）质粒pETDnaK的构建：使用快速限制性内切酶SmaⅠ酶切质粒pEASYDnaK，37℃水浴中孵育5分钟后加入去磷酸化酶继续孵育15分钟后，使用1%琼脂糖凝胶电泳回收热激蛋白DnaK基因片段，将其插入pET259质粒SwaⅠ多克隆位点处，转化至大肠杆菌DH5α中，使用含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基后37℃筛选阳性克隆，获得重组质粒pETDnaK；

3）质粒pETDnaK的诱导表达：将步骤2）所得质粒pETDnaK转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，使用含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基37℃筛选阳性克隆，获得转化子BL21/ pETDnaK，将BL21/ pETDnaK于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡过夜培养；而后转接至新鲜LB培养液中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养4个小时后，收集菌体，并裂解离心收集上清，采用his亲和层析柱纯化重组蛋白，即可获得具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的亚单位疫苗重组蛋白AH DnaK。

4.如权利要求3所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中PCR条件为：94℃ 5min预变性模板DNA,然后94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，5个循环后调整为94℃ 30s，68℃ 1min，72℃ 1min，25个循环后72℃延伸10min。

5.如权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌热激蛋白亚单位疫苗在制备预防和治疗中华鳖对嗜水气单胞菌的侵染疫苗制剂中的应用。