[发明专利]扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其应用。

背景技术

晚期胚胎发生丰富蛋白（Late embryogenesis abundant potein, LEA）最早发现于棉花种子中，因其在胚胎发育后期大量积累而得名（Dure et al., 1981），同时低温、干旱以及盐碱等胁迫，以及脱羧酸（ABA）也会诱导晚期胚胎发生丰富蛋白在植物营养器官中积累。后续研究发现，晚期胚胎发生丰富蛋白不仅存在于植物中，而且在耐辐射球菌（Deinococcus radiodrurana）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、卤虫（Artemia）、线虫以及轮虫（rotifer）中也发现存在晚期胚胎发生丰富蛋白的证据。根据氨基酸序列特征、氨基酸组成上的差异，可将晚期胚胎发生丰富分为不同的类群。

晚期胚胎发生丰富蛋白在细胞内的功能与细胞脱水保护有关。通过转基因技术，将大麦中的HVA1基因转入小麦和水稻，可提高转基因植株的抗旱性；过量表达小麦PM80和PMA1959能够改善水稻植株的抗脱水胁迫能力；将柑橘中编码晚期胚胎发生丰富蛋白CuCOR19的基因导入到烟草中后能够提高转基因植株的抗冷性；在拟南芥中，将小麦WCS19、拟南芥COR15A基因单独过量表达，或者将RAB18、COR17、COR47、XERO2和ERD10五个基因同时过量表达均能够提高转基因植物抵御冻害的能力；小麦脱水蛋白基因WCOR410（晚期胚胎发生丰富蛋白家族成员之一）过表达能够增强草莓的抗冻性。因此，晚期胚胎发生丰富蛋白可能是包括植物、细菌以及低等动物细胞获得脱水忍耐性的决定性因素之一，尽管其具体的机制尚不清楚。同时，晚期胚胎发生丰富蛋白基因也在植物干旱、低温、高盐等非生物胁迫抗性改良中具有重要的潜在应用价值

除了植物遗传转化试验以外，利用大肠杆菌和酵母等异源表达系统也被广泛用来进行晚期胚胎发生丰富蛋白的鉴定。在酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中小麦晚期胚胎发生丰富蛋白过量表达能够提高渗透胁迫的耐受性；将大麦、轮藻的晚期胚胎发生丰富蛋白引入酵母后可以获得对高盐和冷冻胁迫的耐受性。大豆晚期胚胎发生蛋白在大肠杆菌中过表达，能够提高细菌对盐胁迫的耐受性。因此，利用酵母、大肠杆菌表达系统可以作为鉴定晚期胚胎发生丰富蛋白的高效快速体系。

扁蓿豆（Medicago ruthenica）广泛分布于我国北方地区，具有极强的抗逆境能力，是唯一能够在高海拔极端高寒地区正常越冬的苜蓿属多年生豆科牧草。目前还没有扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因克隆和抗逆性功能鉴定的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种改良植物和微生物抗盐、抗冻和耐热性的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供基于该基因在植物和微生物抗盐、抗冻和耐热改良方面的应用。

为解决上述问题，本发明所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，其特征在于：该基因为MrLEA2编码基因，来源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1181位所示的核苷酸序列。

所述基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到1181位中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。

所述基因具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到322位所示的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述基因具有序列表中SEQ ID NO.2第1位到322位所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质；所述由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质的序列与所述等位基因的序列相对应。

如上所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因在改良植物和微生物抗盐、抗冻和耐热方面的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过转录组学分析，从而表明扁蓿豆含有晚期胚胎发生丰富蛋白基因。而本发明通过RT-PCR技术，在扁蓿豆中分离到一个新的晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其编码基因MrLEA2。用原核表达手段，将MrLEA2基因编码区链接到大肠杆菌表达载体后，将该原核表达载体转入大肠杆菌表达菌株，用IPTG诱导后实现了MrLEA2蛋白在大肠杆菌中的过量表达，结果显示，MrLEA2蛋白过量表达在逆境胁迫下对大肠杆菌具有保护效果，因此，通过生物技术方法可将该基因用于改良植物和微生物的抗盐、抗冻和耐热性。