[发明专利]一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，属于生物医药领域。

背景技术

香菇多糖(lentinan)是从香菇中提取具有生物活性的葡聚多糖，其由主链β-(1→3)糖苷键，并由β-(1→6)连接的葡萄糖基沿主链随机分布呈束状分支结构。香菇多糖对多种肿瘤有抑制作用，特别是对消化道类的肿瘤有显著的抑制作用，其具有剂量低，疗效好，毒副作用小等优点。

香菇多糖的分子量及分子量分布与临床抗肿瘤活性有着密切的关系。经研究发现，影响多糖生物活性具有多种因素如：分子组成、链接方式、立体构型、糖链的分支程度等等。其中，分子量的大小是多糖具备生物活性的必要条件。香菇多糖的重均分子量在40～80万道尔顿时，表现出最强的生物活性，此时香菇多糖抑制肿瘤、提高人体免疫的疗效最佳。重均分子量小于2万道尔顿基本上就没有生物活性，对抑制肿瘤的治疗无作用；然而，重均分子量大于200～300万道尔顿时，由于分子量大影响到了香菇多糖的正常溶解(香菇多糖的溶解度是随着分子量的变化而变化的，分子量小的易溶解、分子量大的难溶解)，其生物活性明显下降，更重要的是这么大分子量的香菇多糖静脉注入人体血管内，容易诱发血栓，副作用增大。因此，研究香菇多糖分子量的测定方法对控制香菇多糖内在质量具有重要意义。

目前，测定高聚物多糖分子量的方法所采用的标准物质往往与被测物质的化学结构不相同，再有标准物质分子量范围能否全覆盖被测样品分子量范围等问题。由此建立的为相对标准曲线，所测结果为相对分子量。受到上述条件的影响，所测的结果与物质的实际分子量有较大的误差。因此，需要建立一种适合工业生产的香菇多糖分子量极其分布的测定方法。GPC-LAS联用技术兼具了GPC法和激光光散射法的特点，不需要采用标准物质做出标准曲线而直接快速、准确的测得香菇多糖的重均分子量及分子量分布。

发明内容

本发明的目的是提供一种不需要采用标准物质做出标准曲线而直接快速、准确的测得香菇多糖的重均分子量及分子量分布的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于，具体步骤包括：将待检测的香菇多糖溶解后，加入流动相，调节pH值到9-10，过滤，利用GPC系统进行分离的同时使用示差折光检测器和激光光散射检测器进行检测，将激光光散射检测器检测得到的分子量数据和示差折光检测器检测得到的浓度数据通过GPC软件计算得出香菇多糖的分子量及分子量分布。

优选地，进行分离和检测时，采用的流动相为超纯水、硼酸盐缓冲溶液、硝酸钠溶液和氯化钠溶液中的至少一种，分析柱为1-4根分离范围为2,000，000～1000道尔顿的尺寸排阻色谱柱，柱温保持在20℃-40℃，流速为0.3ml/min—0.9ml/min。

更优选地，进行分离和检测时，采用的流动相为pH＝9.0～10.0的0.12M硼酸盐缓冲液。

更优选地，进行分离和检测时，采用的分析柱为二根分离范围为2,000,000—1000道尔顿的不锈钢柱串联。

更优选地，进行分离和检测时，采用的柱温为30℃。

更优选地，进行分离和检测时，采用的流速保持在0.5ml/min。

更优选地，所述的GPC系统、示差折光检测器和激光光散射检测器的仪器常数校正时采用的标准物质为PEG，验证仪器常数用的标准物质为Dextran。

优选地，所述的GPC软件为Omni Sec4.7软件。

本发明中采用的香菇多糖的分子量、分子式、化学结构式如下：

1、分子量测定

利用示差折光检测仪与激光光散射仪相连接(GPC—LAS)的方法来测定香菇多糖天然大分子高聚物分子量及其分布。测定分子量分布范围大多在1-200万之间。

2、分子式

经微量元素分析结果表明，分子式为(C₆H₁₀O₅）_n

3、化学结构式

经高碘酸氧化及Smith降解等化学反应结合光谱分析法，测定香菇多糖的一级结构式如图1所示，

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用示差折光检测仪与光散射检测仪相连接(GPC-LAS法)测定香菇多糖分子量及其分布，激光光散射检测器提供分子量的直接测量(无需校准曲线)；使用示差折光检测器采集测定浓度，双检测器采集的信息通过GPC软件计算出分子量及其分布信息。本发明能够快速、准确的获得香菇多糖的分子量及分子量分布，对提高该药品的内在品质具有积极意义。