[发明专利]一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用

说明书

技术领域

本发明属于动物医药工程技术领域，具体涉及一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法，还涉及一种表达牛β-防御素5成熟肽的重组菌，同时还涉及一种牛β-防御素5成熟肽在畜牧生产和药物治疗中抗菌作用的应用。

背景技术

防御素(defensin)属于内源性抗菌肽(endogenousantibiotic peptidees)家族，具备广谱抗微生物和细胞毒活性，对机体免疫至关重要。1991年，人们在牛气管黏膜上皮细胞中首次发现β-防御素-2这一阳离子多肽抗生素，命名为TAP(Trachea Antiniobial Peptide)，而后在牛的粒细胞中又发现了13种不同于α-防御素，却与TAP序列高度同源的防御素，故命名为β-防御素。由于β-防御素的结构特点为基因序列中含有两个exon，其中第二个exon编码成熟的β-防御素，即发挥活性的部分，而且成熟β-防御素中含有6个半胱氨酸，可形成3对二硫键，是β-防御素能够发挥生物活性的必要结构。但是动物体内天然防御素的含量较低，直接提取远不能满足需要，化学合成方法可行但成本太高，因此，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为一种可能。

另外，有研究已证实牛巨噬细胞有牛嗜中性粒细胞β-防御素(BNBD)5的表达，且分支杆菌主要感染巨噬细胞，并在巨噬细胞内生存，因此，我们推测BNBD5可能在对抗分支杆菌感染中发挥着重要的作用，并可作为一种分支杆菌的新型治疗药物而广泛使用，因此基于防御素的这一重要特点，我们进行了一种真核表达牛嗜中性粒细胞β-防御素5成熟肽的生产方法的研究。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种真核表达载体，由含有牛β-防御素5成熟肽基因与真核表达载体pPIC9K构建而成的pPIC9K-mBNBD5，所述牛β-防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种编码牛β-防御素5成熟肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种重组菌株，由上述真核表达载体pPIC9K-mBNBD5转化毕赤酵母GS115构建制成的重组菌株。

优选的，所述菌株为毕赤酵母阳性转化子菌株巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris(pPIC9K-mBNBD5)，该菌株已于2014年3月20日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.8937。

本发明提供了一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法，包括以下步骤：

1)牛β-防御素5成熟肽基因的制备：根据GenBank上公布的BNBD5的CDS区域核苷酸序列人工合成mBNBD5基因，并设计PCR引物，

mBNBD5的上游引物：

5′-GCCGAATTCAATCCTCAAAGCTGCCGTT-3′；

mBNBD5的下游引物：

5′-GCCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCTCC TGCAGCAT-3′；

2)上述真核表达载体的构建：双酶切mBNBD5基因和真核表达载体pPIC9K，胶回收mBNBD5基因片段和开环的真核表达载体pPIC9K，16℃连接处理16h，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，即完成重组质粒pPIC9K-mBNBD5的构建；

3)上述重组菌株的制备：将重组质粒pPIC9K-mBNBD5转化到感受态GS115中，筛选阳性转化子，所得阳性克隆即为能够表达mBNBD5的毕赤酵母阳性转化子菌株；

4)毕赤酵母阳性转化子体外诱导表达。

优选的，步骤3)中所述筛选依次为His⁺多拷贝转化子的筛选和Mut⁺转化子的筛选。

优选的，所述步骤4)包括以下步骤：

a、挑取PCR鉴定后证实已插入目的片段的His⁺、Mut⁺酵母转化子接种至YPD液体培养基中，28℃培养16-18h，离心弃上清；