[发明专利]含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及戊型肝炎病毒，具体说是一种含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。

背景技术

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是经消化道、血液传播的一种肝炎病毒。该病毒感染谱十分广泛，目前已证实的感染宿主除人之外，还有其它多种动物，如猪、猴、鸡等。HEV有四个基因型，I型和IV型仅限于人际间传播，III型和IV型为人畜间交叉传播；人感染临床患者多为轻中型肝炎，常为自限性，但孕妇患戊型肝炎病情严重病死率可达20％，因此，世界卫生组织(WHO)将HEV确定为本世纪新发现的一种人畜共患病病原，其导致的全球公共卫生安全问题日益受到各国的关注。相应的开发各种HEV检测技术和方法也变得十分必要和紧迫。

HEV是一种直径约为27nm的无包膜单股正链RNA病毒。HEV基因组全长约7.5kb，在5’和3’非编码区之间含有三个开放阅读框(ORF)，依次为ORF1、ORF2和ORF3。由于病毒核酸及其编码的氨基酸在具有高度同源性的基础之上有着广泛的地理分布和一定的遗传异质性等特点，一因此，在临床上的分子生物学检测中常常以ORF1、ORF2和ORF3为检测目标基因。

以HEV核酸检测为例，一般有以下三个主要步骤需要阳性参照：

1、从标本中提取HEV RNA，包括：病毒外膜、核衣壳打开或破碎，核酸释放。

2、HEV RNA被逆转录为cDNA。

3、cDNA与PCR反应液和DNA多聚酶混合，在PCR仪中扩增并得到信号。

现有的阳性参照，主要有下述几种来源：患者或被感染动物阳性血清；体内或体外转录RNA；质粒或化学合成。

所有阳性参照中，最准确可靠的应该是含该HEV病毒的天然样本(如患者或被感染动物的血液、粪便处理液、细胞培养液)，同质性可充分保证其作为前述三个步骤的阳性参照，但其缺陷在于天然样本来源有限，且存在天然病毒散播的潜在危害性。

克服天然病毒来源少且具有传染性的缺点，一般可通过离体培养来解决，即将HEV导入合适的人工培养宿主细胞系，重组HEV颗粒即可从细胞中产生并分泌至培养上清。然而，该病毒感染谱窄感染滴度低且关键培养步骤只为少数实验室所拥有；另一方面，这种HEV生产方式可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒数量仍然较低、结构不天然、重复性差等。

体外转录的HEV RNA，因为它与标本中待测指标一样，都是RNA，因此可以作为逆转录的阳性参照；但是，由于其不具备病毒外壳，因此不适合作为从标本中提取病毒RNA操作的阳性参照。

用质粒作为阳性参照，其优点是制备纯化容易，但由于质粒是闭合环状超螺旋双链形式，非单线性，不是RNA，因此它只能作为PCR参照，而无法作为RNA提取和逆转录的参照。

至于化学合成法制备RNA阳性参照，以目前技术成本非常高，还会因为没有核衣壳、膜的保护而容易降解，因此到目前为止尚无实际应用的报道。

人工假病毒是将目的RNA病毒基因的特定片断克隆至含有噬菌体基因的表达载体上，通过诱导表达产生被噬菌体衣壳蛋白包被的RNA片断，这种新的RNA质控制备技术又称装甲RNA(Armored RNA)技术(Pasloske B L,et al.Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J].J Clin Microbiol，1998,36(12)：3590-3594)。该技术解决了传统RNA质控品存在的诸多弊端问题(要么稳定性差、要么存在生物安全隐患、要么达不到监测核酸提取及反转录全过程的目的等)。