[发明专利]一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对黄酮类化合物耐受性提高的大肠杆菌工程菌及其构建方法，特别是一种并通过分子手段沉默了malK基因，从而提高了E.coli对黄酮类化合物的耐受能力。

背景技术

黄酮类化合物(Flavonoids)是自然界种类最多的多酚类植物次级代谢产物，广泛存在于植物界中，目前已经发现的种类已超过8000多种。黄酮类化合物具有广泛的药学价值，具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、免疫调节、抗癌、抗病毒、降血糖、抗辐射和降血脂等多种生物学作用。随着对黄酮类化合物生物活性研究的逐步深入，对其的开发利用也越来越多，对其的需求量也越来越大，近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30％以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。但天然黄酮类物质的获得受到时间和区域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和临床检验，并且化学结构很复杂，用化学合成法很复杂，不利于大规模的生产。因此用微生物生产黄酮类化合物越来越受到人们的重视。

随着黄酮类化合物的应用范围越来越广，其需求量也在不断的增大，从植物中提取有各种各样的问题，因此，通过微生物发酵生产黄酮类化合物具有很大的应用前景。目前，黄酮类化合物生物合成的代谢途径已经非常清楚，黄酮类化合物的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A(malonylCoA)和1个香豆酰辅酶A(coumaroylCoA)在查尔酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他种类的黄酮是在母核的基础上通过羟基、甲氧基取代或烷基化等化学反应生成的。大肠杆菌遗传背景清晰，分子操作技术完善，是生物技术生产平台的首选，因此很早就有人通过改造E.coli相关代谢途径生产黄酮类化合物。目前很多研究成功通过基因工程等技术手段实现了多种黄酮类化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜芦醇等。但是黄酮类化合物本身对E.coli生长具有一定的抑制作用，主要是通过以下几种机制：①破坏细胞壁及细胞膜的完整性，改变细胞膜渗透性，进而破坏细胞膜的功能，影响细菌的生长；②抑制核酸的合成，槲皮素，芹黄素，五羟基黄酮等能够抑制E.coli的DNA旋转酶的活性进而抑制DNA的合成。芦丁能够促进E.coli的DNA裂解，导致SOS反应发生，从而抑制菌体的生长；③抑制能量代谢，通过抑制ATP合酶的活力进而抑制胞内ATP的含量，影响菌体的生长。因此利用E.coli生产黄酮类化合物必须要考虑黄酮类化合物对E.coli的毒性作用。

目前在国内未有关于增加E.coli对黄酮类化合物耐受性的相关蛋白的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是是找出能提高E.coli对黄酮类化合物耐受性的相关蛋白并提供一种对黄酮类化合物高耐受性的E.coli工程菌。通过将可用于黄酮生产的大肠杆菌生产菌株中malK基因进行沉默获得。

所述工程菌含有沉默malK基因的质粒。

所述malK基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID NO.1所示。

所述malK基因克隆于E.coli BL21(DE3)菌株，并构建重组质粒pRSF-PTasRNA-malK并转入E.coli BL21(DE3)中。

所述黄酮类化合物为芦丁，柚皮素或白藜芦醇。

本发明的提出的基础及前期试验：

1)在E.coli稳定期时添加黄酮类化合物刺激后收集菌体细胞，提取膜蛋白，通过蛋白质组学的技术手段，发现MalK蛋白的表达量有显著的提高。

2)提高qPCR技术验证该蛋白在这一生理过程中的mRNA水平。

3)通过ncbi查出该基因的核苷酸序列设计引物并克隆。

4)将基因与载体连接得到重组表达载体；

5)将得到的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)后得到重组菌株；

6)重组菌株进行IPTG诱导后通过qPCR验证其mRNA水平是否下降即基因是否被沉默；

7)通过在黄酮类化合物存在的环境下生长曲线的测定，验证该蛋白的过量表达是否提高了E.coli对黄酮类化合物的耐受能力。

下面是本发明技术方案的具体描述：

MalK蛋白的发现