[发明专利]一种伯克氏菌株、其有机磷酯水解酶和基因及其在有机磷农药降解中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株伯克氏属新种菌株Burkholderia jiangsuensis ECU1088，其保藏号为CGMCC9028，该伯克氏新菌株表达的有机磷酯水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，及其重组酶的制备方法，还涉及有机磷酯水解酶或其重组酶作为催化剂降解有机磷农药的应用。 

背景技术

有机磷农药是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，对人体具有较高毒性，威胁人类健康。农药残留是大量施用农药后的必然现象，如果超过最大残留限量，会对人畜产生不良影响，或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害。农药的发明和使用虽然大大提高了农作物的产量和效益，但随着科学技术的发展和人们生活水平的提高，农药残留对环境及人类健康造成的负面影响日益显露出来。 

大量研究表明，土壤微生物对环境中的农药降解起着重要作用，筛选农药降解菌株无疑是控制农药残留量，保护生态环境及人类健康的有效手段，有机磷农药降解菌主要是从有机磷农药污染的土壤、水体或污泥等环境中直接分离筛选或经过富集培养获得。目前已报道的有机磷农药降解菌主要为真菌和细菌，崔中利等人首次从Pseudomonas sp.M6的基因文库中克隆了一种新的有机磷酯水解酶基因mpd(Appl.Environ.Microbiol.,67:4922-4925)，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基对硫磷的活力仅为0.96U/ml，而后，人们分别从Pseudomonas,Bacillus,Stenotrophomonas等种属的微生物中克隆出mpd基因，得到MPH酶。武汉病毒所周宁一等人从Pseudomonas sp.WBC-3中克隆出mpd基因，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基对硫磷的比活力为12.7U/mg(Biochem Biophys Res Commun.,334:1107-1114)，纯酶液为50.5U/mg(Research in Microbiology.,158:143-149)，目前研究报道的重组有机磷酯水解酶催化活力还有待提高，且降解菌株的多样性和新颖性也有待丰富。 

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是丰富降解菌株的多样性，并从中挖掘新的有机 磷农药降解酶。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是： 

1.本发明提供了一株伯克氏新菌株Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028，是发明人从浙江、江苏、上海、陕西等地区的150多份有机磷农药污染的土壤样品中，经过初筛、复筛及分离纯化，得到的产有机磷酯水解酶的新菌株。 

2.筛选菌株所用的培养基为本领域常规使用的培养基，本发明所述培养基优选配方为： 

(1)富集培养基(MSM)配方：(NH₄)₂SO₄1.0g·l^-1,K₂HPO₄0.8g·l^-1,KH₂PO₄0.2g·l^-1,MgSO₄0.2g·l^-1,CaSO₄0.08g·l^-1,FeSO₄·7H₂O0.005g·l^-1,Na₂MoO₄·2H₂O0.0033g·l^-1,用自来水配制，pH7.0，第一轮添加终浓度为25mg·l^-1的甲基对硫磷(MP)，每一轮逐步增加MP的浓度，直至底物浓度达到200mg·l^-1； 

(2)丰富培养基(PY)配方：蛋白胨10.0g·l^-1，酵母膏5.0g·l^-1，氯化钠5.0g·l^-1，用自来水配制，pH7.0； 

3.本发明所述菌株的筛选方法包括以下步骤： 

(1)富集培养：从浙江、江苏、上海、陕西等地不同环境中采取土壤样品。取1g土样加入到5mL第一轮富集培养基中，30℃,180rpm培养3天后，按5％的接种量转接到5mL第二轮富集培养基中，相同条件下继续培养3d，不断传代，至MP浓度为200mg·l^-1；