[发明专利]一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法

权利要求书

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第577位的天冬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。

4.一种获得权利要求1所述突变体的方法，根据SEQ ID NO.1所示的基因序列，分别设计并合成定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码D577A、D577G、D577E、D577R和D577K突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述定点突变引物分别是：

引入Asp577Ala突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3’；

引入Asp577Gly突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3’；

引入Asp577Glu突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3’；

引入Asp577Arg突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3’；

引入Asp577Lys突变的引物：正向引物：5’-GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3’，反向引物：5’-CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3’。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilisWB600的单克隆于含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以体积比4％的接种量接种到含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K。

7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化能力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CGTase的第577位天冬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。

8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。