[发明专利]一种提高大肠杆菌对黄酮类化合物耐受性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高大肠杆菌对黄酮类化合物耐受性的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

黄酮类化合物(Flavonoids)是自然界种类最多的多酚类植物次级代谢产物，广泛存在于植物界中，目前已经发现的种类已超过8000多种。黄酮类化合物具有广泛的药学价值，具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、免疫调节、抗癌、抗病毒、降血糖、抗辐射和降血脂等多种生物学作用。随着对黄酮类化合物生物活性研究的逐步深入，对其的开发利用也越来越多，对其的需求量也越来越大，近年来，黄酮类化合物的市场每年增长30％以上，在药品和营养化学品领域上具有广阔的应用前景。但天然黄酮类物质的获得受到时间和区域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和临床检验，并且化学结构很复杂，用化学合成法很复杂，不利于大规模的生产。因此用微生物生产黄酮类化合物越来越受到人们的重视。

随着黄酮类化合物的应用范围越来越广，其需求量也在不断的增大，从植物中提取有各种各样的问题，因此，通过微生物发酵生产黄酮类化合物具有很大的应用前景。目前，黄酮类化合物生物合成的代谢途径已经非常清楚，黄酮类化合物的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A(malonylCoA)和1个香豆酰辅酶A(coumaroylCoA)在查尔酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他种类的黄酮是在母核的基础上通过羟基、甲氧基取代或烷基化等化学反应生成的。

大肠杆菌遗传背景清晰，分子操作技术完善，是生物技术生产平台的首选，因此很早就有人通过改造E.coli相关代谢途径生产黄酮类化合物。目前很多研究成功通过基因工程等技术手段实现了多种黄酮类化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜芦醇等。但是黄酮类化合物本身对E.coli生长具有一定的抑制作用，主要是通过以下几种机制：①破坏细胞壁及细胞膜的完整性，改变细胞膜渗透性，进而破坏细胞膜的功能，影响细菌的生长；②抑制核酸的合成，槲皮素、芹黄素、五羟基黄酮等能够抑制E.coli的DNA旋转酶的活性进而抑制DNA的合成，芦丁能够促进E.coli的DNA裂解，导致SOS反应发生，从而抑制菌体的生长；③抑制能量代谢，通过抑制ATP合酶的活力进而抑制胞内ATP的含量，影响菌体的生长。因此利用E.coli生产黄酮类化合物必须要考虑黄酮类化合物对E.coli的毒性作用。

目前，FadL蛋白的功能主要是作为大肠杆菌长链脂肪酸外膜转运蛋白，也参与转运一些小分子物质，如：糖类、有机酸和醇类物质等。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种提高微生物对黄酮类化合物耐受性的方法，是在微生物中过量表达FadL蛋白。

编码所述FadL蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述黄酮类化合物是芦丁、柚皮素或白藜芦醇。

所述FadL蛋白的获得，是在E.Coli生长稳定期添加黄酮类化合物刺激菌体，然后收集菌体细胞，提取膜蛋白，通过蛋白质组学分析，发现FadL蛋白的表达量有显著提高，并通过过量表达FadL蛋白进一步验证其功能。

所述FadL蛋白还可应用于提高细胞产黄酮类化合物的能力。

通过在大肠杆菌中过量表达所述FadL蛋白，大肠杆菌对黄酮类化合物的耐受性得到提高。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种对黄酮类化合物耐受性提高的基因工程菌。所述基因工程菌是重组大肠杆菌，是以pACYC-Duet1为表达载体，在E.coli中过量表达FadL蛋白得到。

所述E.Coli是E.coli BL21(DE3)。

本发明确认了FadL蛋白的新功能，在大肠杆菌中过量表达该蛋白，并测定菌体在含黄酮类化合物的环境中的生长曲线，证明该蛋白的过量表达提高了E.coli对黄酮类化合物的耐受能力。当环境中存在1g/L芦丁或柚皮素或白藜芦醇时，相比未过量表达FadL蛋白的菌株，过量表达FadL蛋白的微生物的比生长速率提高了两倍多。

具体实施方式

实施例1FadL的发现