[发明专利]基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物化学传感技术领域，具体涉及一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置及检测方法。

背景技术

光镊即单光束梯度力光阱，是基于散射力和辐射压梯度力相互作用而形成的能够捕获整个米氏和瑞利散射范围粒子的势阱。对粒子起捕获作用的是梯度力，要想将粒子稳定地束缚在光场势阱中，轴向梯度力必须要克服散射力。所以通常需要使用较大数值孔径的显微物镜将激光束高度会聚，从而产生足够强的梯度力来实现粒子的捕获。在生物医学领域，光镊技术往往和光学显微镜技术相结合，实现单个微粒的观察、捕获和操纵，但显微光镊装置尚未应用于高灵敏定量检测。

光镊对微粒的捕获主要有两种方式，一种是散射力小于梯度力，微粒被梯度力稳定在溶液之中，形成悬浮的状态，称为三维捕获；另一种捕获方式是先利用梯度力将微粒捕获到光阱中心，然后由于散射力大于梯度力，最终微粒被推向并压在样品池的底部或顶部，这样微粒最终稳定区域就只在样品池的底面或顶面，故称这种方式为二维捕获，对于以正置显微镜为主体光路结构的光镊系统来说，工作距离有限，故常采用较低倍率的物镜，这类物镜提供的光阱力更适合二维捕获，而且二维捕获也更加简便易行。本专利采用二维捕获方式捕获微球，同时采用同一激光光束实现微球表面富集的待测成分的激光诱导荧光定量检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置。该装置将光镊技术和单光子荧光技术相结合，可实时多通道定量检测多种待测成分（如金属离子、生物分子和病毒粒子等）。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于蓝光光镊的单光子激发荧光多通道定量检测装置，包括功率可调的蓝光激光器，所述蓝光激光器发出的激光束，经过聚焦镜组成的扩束透镜组扩束并准直为平行光，再经过第一双色分光镜进入并覆盖物镜后瞳，经物镜聚集在样品池形成光镊；样品池中待测微球的前向散射光经过第二双色分光镜反射，再由聚焦镜汇聚，照射到四象限光电检测器（QD）上；含有荧光标记物的待测微球发出的荧光穿过物镜和第一双色分光镜，经过反光镜和聚焦镜后，进入分光系统，然后由荧光检测器检测；还包括支撑样品池的电动平台和照明灯。

上述装置，通过四象限光电检测器（QD）检测到的信号值的强弱来判断光阱捕获微粒的情况。

上述蓝光激光器为功率可调的多种类型的小型蓝光连续激光器，波长400nm-500nm。

上述分光系统由光栅、棱镜组成或由干涉滤光片组成。若采用光栅与棱镜的分光系统，荧光检测器为一个线阵或者面阵光电检测器，如线阵CCD、线阵CMOS、以线阵模式工作的面阵CCD或CMOS、或其他衍生的阵列式感光元器件。若采用干涉滤光片，每通道配置点式光电检测器（如光电倍增管和雪崩光二极管），也可配置线阵或面阵光电检测器。本发明中所有光电检测器均具有将光信号转化成电信号输出的能力。

    上述样品池为覆盖盖玻片的载玻片，或无机高分子材料的透明容器，其体积为微升级  。

使用上述基于蓝光光镊单光子激发荧光的多通道定量检测装置的检测方法，包括步骤：

步骤一，利用微米级透明微球特异性捕获待测物，再用荧光探针对富集于微球表面的待测物进行标记，形成微球-待测物-荧光探针复合物，即富集待测物的微球；

步骤二，将富集待测物的微球置于样品池中，利用物镜聚焦蓝光激光器产生的激光束，于样品池中形成光镊；

步骤三，利用电动平台移动样品池，四象限光电检测器同步检测来自样品池的散射光；当，四象限光电检测器检测到散射光强度上升到稳定值时，说明光镊捕获到富集待测物的微球，电动平台停止移动；

步骤四，荧光检测器开始进行荧光检测；根据荧光检测器检测到的荧光强度对待测物进行定量分析。

上述待测物为金属离子、生物分子或病毒粒子等多种可以通过特异性生物亲和或化学偶联方式富集到微球表面的待测成分。

上述微球为透明的无机微球或透明的高分子微球，无机微球可以是二氧化硅等材料制备的微球，高分子微球可以是聚苯乙烯等材料制备的微球。上述微球为微米级的，3-10微米比较适合。

上述富集待测物的微球可采用双抗夹心免疫反应法来获取。所述的荧光探针为荧光染料或纳米量子点。

本方法可用不同荧光探针来标记用微球富集的不同待测物，采用分光系统对不同的荧光信号进行分光，并采用多通道荧光检测器同时检测不同荧光信号的强度，以实现多色荧光信号的多通道检测。