[发明专利]一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法

说明书

技术领域

本发明属于显微观察样品技术领域，涉及一种植物组织冷冻切片的制备方法，具体是一种基于冷冻切片技术的适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，包括适合油棕叶片组织冷冻切片的冷冻切片机的参数设定和包埋纸盒的制作、样品固定、切片、封片和观察等。

背景技术

油棕(Elaeis guineensis Jacq.)是世界上生产效率最高的产油植物，具有广阔的开发利用前景，但是我国油棕产业起步较晚，品种主要从国外引进，尚无具有自主知识产权的油棕新品种，而从国外引进油棕品种需要经过长期的引种、试种观察，才能确定能否在生产上应用，因此，有必要对油棕种质资源进行鉴定评价，从而择优利用种质资源。

叶片解剖结构研究作为鉴定种质资源的重要依据之一，常作为评价植物适应性强弱的重要手段，主要是通过利用植物组织切片在显微镜下观察其结构的特征而得以实现，因此，探索快速获得切片的方法在鉴定评价大量油棕种质时有重要的应用价值，有利于缩短油棕种质资源的鉴定周期。

作为植物组织切片的主要方式，石蜡切片技术存在前处理时间长、操作繁琐等缺点，不利于对油棕种质资源进行大量快速的鉴定。冷冻切片技术弥补了这些缺点，制片周期较短，观察效果好，适合工作量较大的种质资源鉴定工作。探索适合的冷冻切片技术应用于油棕组织解剖结构及细胞学研究中是一个重要问题，以前虽有其它植物组织冷冻切片的报道，但是，不同种类的植物组织有不同的特性，相关结果虽然有借鉴意义，却不能完全应用于油棕组织切片研究，目前，尚未见将冷冻切片技术应用于油棕叶片解剖结构研究的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，采用冷冻切片技术可快速获得结构清晰、完整的冷冻切片，有利于根据叶片的解剖结构开展油棕种质资源的鉴定和评价工作，对于培育或筛选适合我国栽培的油棕品种或种质资源具有重要的意义。

本发明所采用的技术方案：

一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，其步骤如下：

1、冷冻切片机预冷：启动冷冻切片机，冷冻箱设定温度为-20℃，样品头温度设定为-10℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。

2、材料固定：选用硬质白纸，裁剪折叠成长、宽、高均为5mm的纸框作为包埋纸盒，用于放置待切油棕叶片组织及冷冻包埋剂；在样品盘中加入少量包埋剂，然后垂直将包埋纸盒放在样品盘上，再置于冷冻切片机中的冷冻台上，待包埋剂在低温条件下冷冻凝固后完成对包埋纸盒的固定；选取油棕叶片材料，修剪成2mm×2mm大小的方形样品；取出固定好包埋纸盒的样品盘，在包埋纸盒中加入OCT冷冻包埋剂，然后将修剪好的样品垂直放入包埋剂中，将样品盘放入冷冻切片机的箱体中，在-20℃条件下冷冻至冷冻包埋剂完全凝固(约5分钟)，完成待切材料的包埋与固定。

所述油棕叶片材料是指叶片的叶缘、叶尖或叶中部。

3、修剪包埋块：从冷冻切片机的冷冻箱中取出已经冷冻固定的包埋块，快速用手术刀片修剪包埋块，切除包埋块四周的纸壁和多余的包埋剂。修剪过程应该迅速，防止包埋剂融化。

4、切片：这个过程分为三步，首先是样品初切，将样品盘装入样品头，安装刀片，将切片厚度调整至50μm-60μm处，开始初切包埋块，直至除去样品组织边缘(这一步骤是为了修整待切面，为下面获得效果较好的切片做准备，一般在切到待切组织后，再连续切除5-10片可以除去待切叶片组织边缘)；第二步是切取目的厚度的切片，调整切片厚度至5μm，开始切第一片仍为50μm-60μm厚度的切片，切下后清除，再切片即为目前所选5μm厚度，控制样品头匀速运动，可获得所需厚度的连续切片；第三步是观片的获取，将切片吸附到载玻片上，然后快速滴加甘油并盖上盖玻片(由于切片组织较薄，切片粘到载玻片上后很快融化，叶片内部各个结构很容易因脱水而萎缩，使观片时得到的为失真的图像)，得到用于观察油棕叶片解剖结构的切片。

5、观片：将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。

本发明采用冷冻切片技术可快速获得油棕叶片结构完整的冷冻切片，切片平整、无皱褶、厚度均匀，显微结果清晰，具有时间短、结果清晰等优点，有利于开展油棕叶片解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。

附图说明

图1是不同厚度的冷冻切片比较。

图2是不同条件下显微图像结果比较。A、立即滴加甘油并用盖玻片封片；B、延迟滴加甘油并用盖玻片封片；C、不滴加甘油并用盖玻片封片。