[发明专利]一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，属于生物技术领域。

背景技术

由巯基线性DNA或核酸适配体修饰的纳米金复合物(DNA/AuNP)，从自组装材料制备、生物传感技术，到药物传输等领域，都拥有十分重要的应用。但是最近的研究表明DNA碱基会与纳米金表面发生非特异性相互作用，部分吸附在纳米金的表面，使得线性DNA杂交效率下降，使得核酸适配体与其靶标的识别能力下降。因此深入了解线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面的构象，对于优化探针设计具有十分重要的价值。现阶段对线性DNA在平面金表面上的构象研究较多，有多种表征技术，例如X射线光谱，表面等离子体共振等都被用于线性DNA在平面金表面上的构象研究。但是对于线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面上构象的研究却很少。目前仅有琼脂糖凝胶电泳技术被用于线性DNA在纳米金表面上构象的系统研究(Parak，W.J.；Pellegrino，T.；Micheel，C.M.；Gerion，D.；Williams，S.C.；Alivisatos，A.P.NanoLett.2003，3，(1)，33-36.)。该方法通过测定DNA/AuNP在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率计算其有效粒径，然后通过其有效粒径测定线性DNA的构象。琼脂糖凝胶电泳技术虽然可以用于研究线性DNA的构象变化，但是这种方法却存在许多缺陷：1.琼脂糖凝胶电泳技术需要的样品量较大，样品不能重复使用，费时费力，不适合动力学研究；2.短链DNA(小于40个核苷酸)修饰的纳米金在实际应用中很常见，但是琼脂糖凝胶电泳无法获得单条短链DNA的分辨率；3.凝胶方法计算所得的DNA/AuNP粒径实验误差较大，受凝胶比例影响，需要多次测量，费时费力；4.纳米金在琼脂糖凝胶电泳之前需要修饰提高纳米金稳定性的小分子，防止电泳时发生聚集，但在实际应用中这些小分子的存在却会干扰DNA在纳米金表面的实际构象情况，从而无法得到正确的构象信息；5.具有二级构象的适配体DNA会折叠成为紧密的二级结构，影响电泳的迁移率，从而影响对构象的研究。因此非常需要寻找一种可以高效、精确和灵敏的表征方法来探测线性DNA或核酸适配体探针在纳米金表面上的构象。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定纳米金表面上巯基修饰线性DNA或核酸适配体构象的方法，该方法包括如下步骤：步骤一：利用动态光散射(DLS)测定线性DNA或核酸适配体的纳米金复合物在其组装过程中的水合粒径，步骤二：结合吸附动力学模型拟合，并通过对线性DNA或核酸适配体纳米金复合物水合粒径的直接比较，测定在不同表面容量时线性DNA或核酸适配体在纳米金表面上的构象。

本发明的具体实验步骤：

(1)利用动态光散射测定组装过程中不同长度巯基修饰线性DNA或核酸适配体纳米金复合物的水合粒径的动态变化过程；

具有巯基修饰的线性DNA或核酸适配体与二硫苏糖醇(DTT)在2％(V/V)的三乙胺(TEA)溶液下还原后利用NAP-5柱进行两次纯化。纯化后的线性DNA或核酸适配体与纳米金(AuNP)按照一定物质的量比例混合于磷酸盐缓冲液(10mM PB，pH7.4)中，室温(25℃)下孵育并利用动态光散射测定DNA/AuNP粒径变化过程。包被过程包括三个阶段：老化，加盐，温育。老化过程即包被后的17个小时内，使线性DNA或核酸适配体通过自组装过程包被于纳米金表面，该过程不另外添加盐，选取多个时间点测定粒径值；加盐过程即老化过程完成后，逐渐向纳米金与线性DNA或核酸适配体混合溶液中滴加浓度为1M氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲溶液使得盐浓度缓慢增至0.3M，选取多个盐浓度点测定DNA/AuNP的粒径；温育过程即加盐过程完成之后等待一段时间使线性DNA或核酸适配体更加完全地包被于纳米金表面，选取数个时间点测定粒径。

(2)荧光测定老化过程中DNA在纳米金表面DNA链数；

利用荧光标记和巯基修饰的线性DNA或核酸适配体在(1)相同的条件下还原并与纳米金包被。在老化过程中(0-17h)选取数个时间点对样品进行离心纯化，将包被上DNA链的纳米金沉淀复溶于二硫苏糖醇(DTT)磷酸盐缓冲溶液并过夜并离心取上清，根据标准曲线测定其上清液探针浓度并计算每个纳米金上DNA的包被量。相对应公式为：

(3)老化过程DNA在纳米金表面吸附动力学拟合；