[发明专利]一种蛋白质定点修饰的新方法

权利要求书

1.一种蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）定量称取合成标签加入到MQ超纯水中配置成50 mM的合成标签溶液，（2）向蛋白质ubiquitin E18C中加入1.5倍量的TCEP，并调节pH为7.5，静置，（3）将蛋白质ubiquitin E18C逐滴加入到5-10倍体积量的合成标签溶液中，并保证滴加过程及最终pH为7.5左右，（4）采集反应不同时间之后混合物的¹H-¹⁵N HSQC谱图，对反应进程进行检测，直到反应完全为止，（5）反应完全后，通过PD10脱盐柱或者阴离子交换柱进行产物分离，将多余的标签与新生成的小分子物质除去，修饰完成；

  其中合成标签包括具有双功能基团的顺磁标签T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7和T8，其结构式如下： 

。

2.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T1的合成方法为2,6-二甲基吡啶通过溴素溴化在吡啶环3位上一个溴原子，双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化得到第一中间体22，溴化，去氮氧化物，溴代，用NBS进行第二次溴代，然后和亚氨基二乙酸二乙酯反应生成第二中间体28，最后与苯亚磺酸钠反应，水解得到T1。

3.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T2的合成方法为2,6-二甲基吡啶通过溴素溴化在吡啶环3位上一个溴原子，双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化得到第一中间体22，溴化，去氮氧化物，溴代，用NBS进行第二次溴代，然后和亚氨基二乙酸二乙酯反应生成第二中间体28，最后与甲基亚磺酸钠反应，水解得到T2。

4.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T3的合成方法为2,6-二甲基吡啶通过溴素溴化在吡啶环3位上一个溴原子，双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化得到第一中间体22，去氮氧化物，溴代，用NBS进行第二次溴代，然后和亚氨基二乙酸二叔丁酯反应，最后用三氟乙酸水解得到T3。

5.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T4的合成方法为白屈氨酸溴化，酯化得到第三中间体36，接着用硼氢化钠还原，溴代，和亚氨基二乙酸二乙酯反应，最后与苯亚磺酸钠反应，水解得到T4。

6.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T5的合成方法为2,6-二甲基吡啶通过双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化，去氮氧化物得到第四中间体43，用NBS进行溴代，然后和亚氨基二乙酸二叔丁酯反应，最后用三氟乙酸水解得到T5。

7.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T6的合成方法为白屈氨酸溴化，酯化得到第三中间体36与苯亚磺酸钠反应，水解得到T6。

8.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T7的合成方法为白屈氨酸溴化，酯化得到第三中间体36与甲基亚磺酸钠反应，水解得到T7。

9.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T8的合成方法为2,6-二甲基吡啶通过双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化，去氮氧化物得到第四中间体43用三氧化铬氧化得到T8。