[发明专利]表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，尤其涉及构建带有鸡卵清白蛋白启动子区和人血清白蛋白基因的慢病毒表达载体pLVX-Neo-pOVA-hALB-IRES-ZsGreen，属于基因工程技术和生物制药领域。

背景技术

人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67kDa，白蛋白是血浆中含量最高的蛋白质。白蛋白具有维持血液渗透压、抗休克、运输与解毒、促进肝细胞修复与再生等作用，是国际上使用最多的血液制品。临床上主要用于烧伤、失血性休克、水肿、低蛋白血症等的治疗。

医用血清白蛋白的传统获得方法是从健康人血浆中提取，但由于血浆制品具有污染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使该方法受到很大限制，难以得到足够的血液制品。目前我们国家每年需要白蛋白120吨，而通过献血能制备的白蛋白仅为所需求量的1/3，因此，白蛋白供应严重紧缺。

目前重组生物制药中普遍采用酵母、大肠杆菌发酵制备，但此方法存在诸多的缺点，例如：微生物与人体环境差异大，表达产品生物活性低、掺杂的微生物毒素难以彻底去除，生产工艺复杂，很难形成规模化生产，因此，迄今为止，还没有相关产品上市。最近也有国际公司利用转基因技术制备转基因动物来制备人重组蛋白产品，与传统的微生物表达系统相比，动物生物反应器具有以下特点：1)生产的蛋白质生物活性高，能够对重组蛋白质进行多种翻译后加工，非常接近天然产品；2)表达量大、成本低；3)产品易提纯、质量高，避免了其他生产方式的化学及生物毒素的污染，安全可靠；4)易产业化：转移的目的基因能够遗传，使某一群体都具有同一特性，可通过动物繁殖扩群，进行规模化生产。

最早的进行转基因鸡的方法是通过逆转录病毒(Lentiviral vector)来进行的，这些病毒能够感染处在分裂期的细胞，在其宿主的正常生命周期中专一性的将基因整合到宿主的染色体中。但是由于逆转录病毒在干细胞中表达效率低，要得到转基因动物是比较困难的。目前ALV载体已经用于产生转基因禽类，但是转化的效率不是很高，只有10％，而且在56只小公鸡中只有一只能够产生携带转基因精子。而且这只小公鸡产生的转基因精子的比率也十分的低，只有0.7％，效率很低。

相比之下，慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。此外慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种转基因的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。

近年来转基因鸡的技术已经十分成熟并且成为了新的研究热点，全世界有多种抗体以及医疗用蛋白通过转基因鸡生产，无论是实验技术、实际效果还是经济效益上，利用鸡输卵管作为生物反应器生产有药用价值重组蛋白质的前景都十分光明。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，以及进一步培育出鸡蛋中能够表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法。

本发明旨在通过转染效率高的慢病毒对鸡胚胎进行遗传修饰，将外源的人血清白蛋白基因随机插入到鸡胚的细胞中，改变这些细胞基因组的组成，一旦被感染的胚胎细胞中包括了生殖细胞，那么将会在其子代中出现可遗传的带有人血清白蛋白的转基因鸡，由于通过基因工程的方法将慢病毒载体中的CMV启动子换成了鸡卵清白蛋白的启动子，从而将非特异性的表达变成了组织特异性的表达，即目的基因的表达会与卵清蛋白的表达位置相同。这样通过杂交筛选能够培育出在鸡卵(鸡蛋)中表达人类血清白蛋白的转基因鸡，并且确保这种遗传修饰的改变能够被子代继承，长久的传递下去。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明将适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反应元件以及人血清白蛋白的基因重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆，构成人血清白蛋白在鸡输卵管组织特异性表达的慢病毒载体pLVX-Neo-pOVA-hALB-IRES-ZsGreen，具体技术方案如下：