[发明专利]一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因方法

权利要求书

1.一种定位植物控制同一性状的两个非等位基因的方法，其特征在于具体的步骤如下： 

1)选取具有某一性状的植株，假定该性状受2个非等位基因A和B控制，A和B突变后该性状变为突变性状，那么野生型的基因型为AABB，表现为正常性状，而突变体的基因型为aabb，表现为突变性状； 

2)将野生型和突变体杂交获得F1，F1的基因型为AaBb，表现同野生型，为正常性状； 

3)F1自交后获得F2分离群体，共有9种基因型AABB、AABb、AAbb、AaBB、AaBb、Aabb、aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/16，所以F2群体的正常性状和突变性状的分离比表现为15：1； 

4)将F1用突变体回交，产生的BC1F1分离群体共有4种基因型AaBb、Aabb、aaBb、aabb，各占1/4，所以BC1F1群体的正常性状和突变性状分离比表现为3：1； 

5)取若干正常性状的BC1F1单株自交，获得各自的BC1F2分离群体； 

由于1/3的BC1F1正常性状的单株基因型为AaBb，那么其自交产生的BC1F2分离群体与F1相同，有9种基因型，正常性状和突变性状的分离比表现为15：1； 

另有1/3的BC1F1绿色单株基因型为Aabb，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型AAbb、Aabb、aabb，其中aabb占1/4， 所以正常性状和突变性状的分离比表现为3：1；由于正常性状和突变性状的分离只与A的基因型的分离相关，含有A为正常性状，不含A则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于A基因分离的群体，用分子标记对A基因进行定位； 

剩余1/3的BC1F1绿色单株基因型为aaBb，，那么其自交产生的BC1F2分离群体有3种基因型aaBB、aaBb、aabb，其中aabb占1/4，所以正常性状和突变性状的分离比表现为3：1；由于正常性状和突变性状的分离只与B的基因型的分离相关，含有B为正常性状，不含B则为突变性状，故这个BC1F2群体是关于B基因分离的群体，可以用分子标记对B基因进行定位。 

2.一种利用权利要求1所述的方法定位控制普通烟草茎秆颜色的两个非等位基因，其特征在于具体的步骤如下： 

1)正常中烟100的茎秆基部呈绿色，突变体的茎秆基部呈白色，用突变体和一个茎秆为绿色的烟草品种红花大金元杂交，获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体，F1同时用红花大金元回交获得BC1F1分离群体。对F2和BC1F1群体中茎秆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现绿白分离比分别符合15：1和3：1，这表明白色茎秆性状受2个隐性基因控制，我们分别将其命名为c和d，那么它们对应的显性基因分别为C和D； 

2)从步骤1中的BC1F1分离群体中选取了9株茎秆绿色的单株自交，获得各自的BC1F2分离群体，分别编号为1-9号；对这些群体中茎秆绿色和白色的单株数进行了统计和卡方检验，发现1-4号的 4个群体的绿白分离比符合15：1，而另外5-9号的5个群体的绿白分离比符合3：1，这表明第5个群体对应的上一代BC1F1单株的基因型为Ccdd或ccDd，可以用来对c基因或d基因进行定位； 

3)采用烟草SSR分子标记进行基因定位 

根据普通烟草SSR标记连锁图M，选取1376对SSR引物对突变体和红花大金元的基因组DNA进行PCR，PCR产物经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，共获得183对在突变体和红花大金元之间有多态性的引物，用这些引物对第5号BC1F2群体的10个绿色茎秆单株和10个白色茎秆单株的基因组DNA进行扩增和电泳检测，发现第5连锁群上的引物PT61414在10个白色茎秆单株，即隐性单株中只有2个单株发生交换，而在10个绿色茎秆单株中没有观察到交换，我们进一步用该引物检测了第5号群体中剩余的41个隐性单株，最终从51个隐性单株中共发现6个交换单株，这表明该引物与第5号群体中的控制基因连锁，我们假定该基因为c； 

4)采用与步骤3相同的方法，提取第6-9号BC1F2群体中各10个绿色茎秆单株和10个白色茎秆单株的基因组DNA，用PT61414进行检测，发现该引物与第6、7号群体中的控制基因连锁，但不与第8、9号群体中的控制基因连锁，这样第5-7号群体对应的上一代BC1F1单株的基因型为Ccdd，而第8、9号群体对应的上一代BC1F1单株的基因型应为ccDd； 

用183对多态性SSR引物对第8号群体的11个绿色茎秆单株和10个白色茎秆单株的基因组DNA进行扩增和电泳检测，发现第24 连锁群上的引物PT53716在10个白色茎秆单株，只有3个单株发生交换，而在11个绿色茎秆单株中没有观察到交换，我们进一步用该引物检测了该群体中剩余的38个隐性单株，最终从48个隐性单株中共发现4个交换单株，这表明该引物与d基因连锁；这样，我们分别定位了控制普通烟草白色茎秆性状的2个非等位基因，它们分别位于普通烟草第5和24SSR标记连锁群上。