[发明专利]一种Rh血型DEL型RHD838G>A等位基因及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RHD838G>A等位基因及其检测方法，具体涉及一种掺杂于野生型基因簇中的已知突变基因的方法，属于分子生物学分析检测技术领域。 

背景技术

Rh血型是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统，也是引起临床输血反应和严重新生儿溶血病的主要红细胞血型。目前已发现50多种Rh血型抗原，其中RhD抗原具有很强的免疫原性，是由RHD基因编码产生，是血型研究的重点。临床上根据红细胞膜表面是否检测到D抗原，将Rh血型抗原分为RhD阳性和RhD阴性两大类。 

1984年日本学者Okubo等对经直接凝集试验和间接抗人球蛋白试验(IAT)确认的RhD阴性样本通过吸收放散试验进一步检测，发现一部分个体红细胞表面仍可检测到D抗原的存在，称之为D放散型(DEL型)。它属于弱D型的一种，抗原性极弱。与白种人相比，DEL型在中国RhD阴性人群中比率甚高。Shao等对广东深圳地区大样本调查结果显示，DEL型在我国通过常规血清学鉴定的RhD阴性人群中所占比率约为26％，台湾学者报道该地区的比率是32.6％。Wagner等进行大样本调查发现DEL型在欧洲白色人种中罕见。不同地区不同种族因存在遗传背景的差异，DEL血型D抗原的基因型也存在较大差异。近年来有关DEL血型RHD基因的研究成为红细胞血型研究的热点。陆续发现DEL血型RHD基因中有新的等位基因存在，并具有明显的遗传特性。 

目前，DEL血型D抗原的常规检测方法是采用血清学盐水法和间接抗人球蛋白试验以及吸收放散试验进行鉴定。该方法不仅操作繁琐、结果也存在不稳定性。此外，由于疾病或其他因素的影响，某些个体的红细胞在血清学定型时结果难以判断；慢性长期输血患者血清学结果有时呈现“混合视野”的现象；当无法获得样本的红细胞或红细胞样本不足时，像胎儿血型鉴定、法医鉴定遗留物等，血清学检测也不能获得正确结果。 

用免疫血清学的方法对DEL血型的检测有赖于使用的抗-D抗体的特异性和操作方法，可靠性性较低，而且由于步骤繁琐而不适合临床大规模应用，可靠的方法是应用基因检测的方法检出DEL血型。此时通过检测DNA确定DEL血型D抗原基因型，不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。近年来DEL血型D抗原不断有新的等位基因被发现，本研究小组最近也发现了1例DEL血型RHD基因型RHD838G>A突变的新等位基因，并针对新发现的RHD838G>A等位基因建立了相应的检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供Rh血型DEL型RHD838G>A突变基因及其检测方法，通过检测RHD838G>A基因突变进行Rh血型DEL型基因型分析并作为DEL 血型的表型鉴定指标。 

本发明的检测方法是利用人类DEL血型不同基因型的特异性序列位点的改变，设计出针对性的引物序列，进行聚合酶链反应来完成的。 

按照本发明提供的技术方案，一种Rh血型DEL型RHD838G>A等位基因，其野生型基因DNA序列如SEQ ID NO：1所示，突变基因DNA序列如SEQ ID NO：2所示。 

从待测样品中得到核苷酸序列与RHD野生型的序列进行比较，核对突变是否为838G→A突变。所述RHD突变基因的编码蛋白质具有280A→T氨基酸序列的改变。 

所述Rh血型DEL型RHD838G>A等位基因的检测方法，通过基因扩增方法对包含突变基因的目标部位的检测区选择性地进行扩增，由此检测该突变基因的有无；所述检测方法如下： 

(1)提取待检样本中DNA； 

(2)以该DNA为模板，针对RHD838G>A突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物； 

(3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成； 

(4)将核苷酸序列与RHD野生型基因的序列进行比较，确定是否有838G→A突变。 

通过数据库BLAST比对功能，按照正常读码框架进行翻译以确定是否存在280A→T氨基酸突变位点。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。 

所述Rh血型DEL型RHD838G>A等位基因的检测方法，具体步骤如下：