[发明专利]一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法。

背景技术

Tth DNA Polymerase（Tth DNA聚合酶）是一种热稳定性酶，分子量为94kDa，原始酶的来源是从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB-8中分离得到。该酶在74℃是可进行DNA复制。Tth DNA聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核苷酸5’-3’方向发生聚合反应，形成双链DNA，也可在锰离子存在的条件下，以RNA为模板沿5’-3’方向发生核苷酸聚合反应。该酶也具有5’-3’外切酶活性。Tth DNA聚合酶可用于PCR、逆转录、RT-PCR和较高温度条件下的引物延伸反应。特别适合应用于一步法qRT-PCR试剂盒的开发。

最初Tth DNA聚合酶的来源是从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB-8中分离得到，由于嗜热栖热菌培养所需要的设备昂贵、培养基配置复杂、培养温度高、培养周期长，在培养过程中容易出现误差导致培养效率低下，不易于大规模培养，再加上纯化过程中需要漫长的层析过程，导致酶活性大量下降，因此酶的产能极其有限。

目前，因活性蛋白容易变性失活因而纯化都是要求在低温条件下进行（冰上操作），常规纯化Tth DNA聚合酶方法采用低温超声破碎，反复通过硫酸铵沉淀、离子交换、层析和脱盐进行纯化，不仅高达50%的蛋白会在纯化初期就会损失，而且部分基因组蛋白很难完全去除，再加上基因组蛋白的存在会导致上柱速度缓慢，延长纯化时间，纯化得到的蛋白酶活降低，影响了后期酶的扩增和逆转录活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单，酶活性损失小，回收蛋白的纯度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。

为实现上述目的， 本发明提供一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法，其步骤为，

1）工程菌的活化和表达：取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，振荡培养后加入IPTG诱导培养8小时；离心收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，离心；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；

2）粗蛋白制备：将所述表达的工程菌用溶菌酶室温处理后加入DTT，再加入吐温-20，冰上处理一段时间，15000g/4℃/20分钟，得到的上清即为粗蛋白；

3）粗蛋白中缓慢加入二氧化硅颗粒，磁力搅拌器上搅拌，离心去除沉淀；

4）上清液补足NaCl后流过已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，该柱先用10倍床体积结合缓冲液平衡；所述结合缓冲液为20mM Tris-HCL，0.5MNaCl,PH8.0，5mM咪唑；再用5倍床体积洗涤缓冲溶液依次洗涤，所述洗涤缓冲液为20mM Tris-HCL,0.5MNaCl,PH8.0，15mM/50mM咪唑；最后用洗脱液洗脱目的蛋白，所述洗脱液为20mM Tris-HCL,0.1MNaCl,PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脱液；含目的蛋白的洗脱液用sephadexG25脱盐，脱盐缓冲液为缓冲液B： 10mM Tris-HCl ，pH 7.5 ，25°C， 300mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA；脱盐后即得到纯化的Tth DNA聚合酶；

任选的，得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使体积分数为50%，-20℃保存。

所述Tth DNA聚合酶工程菌为从嗜热栖热菌HB-8中PCR扩增得到PCR产物，所得PCR产物经NdeⅠ、SalⅠ双酶切后克隆入经NdeⅠ、SalⅠ双酶切的PET28a载体上，构建表达载体PET28a-taq，将上述质粒转化表达菌BL21(DE3)，即获得生产重组Tth DNA聚合酶的工程菌株。

所述PCR扩增所用的引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

所述步骤1）为取Tth DNA聚合酶工程菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取活化好的菌液转接到同样的LB液体培养基中，37℃，250 转/分振荡培养4小时后加入1M IPTG至终浓度1.0mmol/L，28℃、250 rpm件下培养8小时；用离心管超声洗涤30min，并用双蒸水润洗一次；12000rpm,4℃离心5分钟收集菌体；收集的菌体用缓冲液A洗涤一次，12000rpm，4℃离心5分钟；再用缓冲液A重悬得到表达的工程菌；所述缓冲液A为20mM Tris-HCL,0.2MNaCl,PH8.0。