[发明专利]黄鳝雌激素受体α基因、编码蛋白及酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及黄鳝雌激素受体α基因、编码蛋白及酶联免疫检测方法。

背景技术

黄鳝(Monopterus albus),又名鳝鱼，主要生活在亚洲地区, 目前中国只有1种, 具有较高的营养价值。自从七十年代开始人工养殖以来, 野生黄鳝苗种便被大量捕捉，同时环境污染等造成黄鳝野生资源日渐减少, 养殖苗种严重短缺。黄鳝发育周期中存在性逆转的现象，开始发育时黄鳝为雌性，性成熟产卵后, 雄性生殖细胞开始发育, 形成间性阶段，逐渐发育成雄性黄鳝。

黄鳝发育周期中性逆转的现象是刘健康等首先发现的(刘健康，顾国彦.鳝鱼性逆转时生殖腺组织的改变,水生生物学报,1951，2（1-2）：85-109)，而后肖亚梅(肖亚梅，刘筠.黄鳝由间性发育转变为雄性发育的细胞生物学研究.水产学报, 1995，19(4):297-301；肖亚梅.黄鳝繁殖生物学研究:1.黄鳝的雌性发育.湖南师范大学自然科学学报. 1995,18(4):45-52)等详细的研究了黄鳝性腺发生与分化的过程,从而表明黄鳝开始发育时为雌性，雌性性成熟产卵后, 性腺内卵细胞逐步败育, 卵巢结构退化, 同时雄性生殖细胞开始发育, 形成间性阶段，通过这一阶段黄鳝过渡到雄性发育, 最后形成雄性的黄鳝。黄鳝性别决定基因或在基因水平上调控黄鳝性逆转一直以来都是研究者们关注的热点，而性别决定又是一个涉及多基因不同时空的复杂调控过程。

性类固醇激素( sex steroid hormone) 是调节脊椎动物下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟及维持各项功能的重要激素。动物体内内源性类固醇激素主要有雄激素、雌激素和孕激素三种，它们的生理功能主要都是通过经典的雌激素核受体介导的。雌激素受体与雌激素特异性地结合后介导雌激素应答元件 (estrogen respond elements，EREs)调节基因的转录。硬骨鱼类的ER种类和生理功能等似乎比高等脊椎动物更为复杂。首个鱼类ERα是由Pakdel 等从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑中分离得到的，迄今为止，有10余种鱼类的ERα已进行了研究报道。

激素的酶联免疫测定具有无放射性污染，标记物稳定，标记酶来源广泛、经济，灵敏度、特异性与放免测定相当等特点，使得激素的酶免测定方法有望替代放免测定技术。但酶联免疫测定需要较多的激素标准品，用常规的垂体抽提技术需要大量的垂体。

发明内容

本发明提供了黄鳝雌激素受体α蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

编码上述蛋白质的黄鳝雌激素受体α基因。

所述的黄鳝雌激素受体α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了含有上述黄鳝雌激素受体α基因的载体。

上述的载体，是指在EcoR I和HindⅢ位点之间插入上述黄鳝雌激素受体α基因的pMAL。

本发明还提供了用于黄鳝雌激素受体α基因的酶联免疫检测方法，包括如下步骤：

(1)抗原的制备：将黄鳝雌激素受体α基因插入载体中，并在大肠杆菌中表达，得到的ERα重组蛋白，经纯化后作为抗原；

(2)抗体的制备：将(1)中所得到的抗原免疫鼠制备得到抗黄鳝雌激素受体α抗体；

(3)抗体的纯化：对(2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐，得纯化抗体；

(4)纯化抗体的标记：用酶标记(3)中所得的纯化抗体，得到酶标抗体；

(5)标准曲线的绘制：用不同浓度的抗原包被在固相载体上，通过与(4)中所获得的酶标抗体结合后，进行测定，绘制抗原浓度与OD值的标准曲线；

(6)样本测定：对待测样本进行测定，通过标准曲线得出待测样本中抗原的含量。

进一步地，步骤(1)中是通过将黄鳝雌激素受体α基因插入至pMAL-c2x的EcoR I、HindⅢ的位点之间，转化大肠杆菌TB1，获得融合蛋白；再对融合蛋白的MBP蛋白酶切后，得到ERα重组蛋白。

进一步地，所述的步骤（4）中，所用的酶为辣根过氧化物酶。

本发明还提供了黄鳝雌激素受体α的酶联免疫检测试剂盒，包括有上述的黄鳝雌激素受体α蛋白质及其对应的抗体，所述的抗体是通过黄鳝雌激素受体α蛋白质在小鼠免疫反应制备得到。

本发明还提供了黄鳝雌激素受体α基因在黄鳝ERα受体检测中的应用。

有益效果