[发明专利]一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括(1)10×PCR Buffer，其成份为100mmol·L^-1Tris-HCl，PH8.3，500mmol·L^-1KCl；(2)2.5mmol·L^-1的dNTP；(3)25mmol·L^-1的MgCl₂；(4)5U·μL^-1Taq酶；(5)10μmol·L^-1的引物ITS1/ITS4，其中ITS1序列为5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，ITS4序列为5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；(6)10μmol·L^-1的引物ITSP1/ITSP2，其中ITSP1序列为5＇-CCAGATACCCTTTGTGAACT-3＇，ITSP2序列为5＇-TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3＇；(7)灭菌双蒸水。

2.根据权利要求1所述的板栗疫病菌巢式PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下：

(1)板栗组织DNA提取

采集疑似病害的板栗枝干组织，用刀片切取约100mg小块组织，表面用70％酒精消毒后蒸馏水冲洗，用吸水纸吸干后，置于研钵中用液氮研磨成粉末，进行DNA提取，提取步骤参见TIANGEN公司Plant Genomic DNA Kit试剂盒说明书；

(2)第一轮扩增

利用引物ITS1和ITS4对步骤(1)中提取的DNA进行扩增，其PCR反应体系为：反应的混合液体总体积为25μL，其中2.5μL10×PCR Buffer，10μmol·L^-1的引物ITS1/ITS4各0.8μL，2μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2μL25mmol·L^-1的MgCl₂，0.2μL5U·μL^-1Taq酶，模板DNA提取液1μL，加灭菌双蒸水补足25μL；将反应混合液于Mastercycler Personal PCR仪上进行扩增，程序为94℃预变性4min；94℃变性40sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)第二轮扩增

取(2)中第一轮扩增产物稀释100倍，作为第二轮扩增的模板DNA提取液，利用引物ITSP1/ITSP2对其进行扩增；其PCR反应体系为：反应的混合液体总体积为25μL，其中2.5μL10×PCR Buffer，10μmol·L^-1的引物ITSP1/ITSP2各0.8μL，2μL2.5mmol·L^-1的dNTP，2μL25mmol·L^-1的MgCl₂，0.2μL5U·μL^-1Taq酶，模板DNA提取液1μL，加灭菌双蒸水补足25μL，以灭菌水代替模板DNA设置阴性对照；将反应混合液于Mastercycler Personal PCR仪，PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性40sec，60℃退火30sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸7min；反应结束后取5μL PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在紫外灯或凝胶成像系统下观察条带，如果存在462bp的条带，则判断所检测组织样品中含有板栗疫病菌，反之则不存在该菌。