[发明专利]鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和检测技术领域，涉及一种致敏乳剂试剂及其制备方法和应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella Anatipestifer,RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和多种其它鸟类的接触性传染疾病，又称为新鸭病、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病和鸭传染性浆膜炎等，是目前危害养鸭业的主要传染病之一。该病呈急性或慢性败血症过程，病理变化主要是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等。1-8周龄鸭高度敏感，恶劣的环境条件或并发感染更易引起该病的发生和流行，死亡率高。耐过鸭常生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，而且该病在发病场能持续存在，引起不同批次的鸭感染发病，难于根治，给养鸭业造成严重的经济损失。

除药物防治以外，目前已成功研制出弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗来控制RA病。因用药物防治易造成菌株的耐药性，鸭群反复发病，难于根治，而用疫苗来免疫接种，可以获得较好的预防效果。由于RA的血清型多而复杂，国际公认有21个血清型，我国也存在10多个血清型，且各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给RA的疫苗防治带来一定困难。比较有效的方法是针对当地主要流行血清型，选取相应菌株研制疫苗，以达到更有效的防治效果。

外膜蛋白(OMPs)是革兰阴性菌特有的一种结构蛋白，很多革兰阴性菌的OMPs具有良好的免疫原性，是亚单位疫苗的候选组成部分，是目前的研究热点。RA的D15蛋白与副猪嗜血杆菌和流感嗜血杆菌外膜蛋白D15一样，均属于Omp85家族。Omp85为暴露于细菌表面且相对保守的外膜蛋白，为其他外膜蛋白的定位和折叠于外膜所必需；除细菌外膜外，Omp85在真核生物线粒体和叶绿体的外膜中也存在。Omp85家族蛋白在结构上具有两个重要特征：氨基酸序列N端位于周质区，富含多肽转运相关区域片段(polypeptide transport-associated domain,POTRA)；而其C端的β桶状区域则包埋于外膜中。多杀性巴氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、杜克雷嗜血杆菌、痢疾杆菌等细菌均有属于Omp85家族的外膜蛋白，并且在氨基酸序列上具有较高的相似性。近十年来，属于Omp85家族的多种细菌外膜蛋白被确认与致病机理和免疫性相关。

对RA抗体的检测是评价RA疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。乳胶凝集试验是以乳胶颗粒为载体，将抗原或抗体通过物理吸附法或化学交联法等固定至载体上制得致敏乳胶试剂，再用以检测对应抗体或抗原的方法。由于具有快速敏感、简单易行、无需昂贵仪器等优点，该方法已广泛用于多种动物疾病抗原抗体的检测和流行病学调查。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，可通过乳胶凝集试验检测RA抗体，检测具有特异性、重复性和敏感性；目的之二在于提供该致敏乳胶试剂的制备方法，偶联效率高，产品凝集效果好；目的之三在于提供该致敏乳胶试剂在制备检测试剂中的应用。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，为表面包被有RA表面抗原D15截短重组蛋白的乳胶颗粒，所述RA表面抗原D15截短重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，是利用水溶性碳二亚胺将RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得。

进一步，所述RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法具体包括以下步骤：取10wt％乳胶原液，用0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液离心洗涤，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液离心洗涤并重悬，加入2wt％EDAC溶液，37℃振摇反应使乳胶颗粒表面的羧基活化，离心弃上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液离心洗涤并重悬至浓度为0.5～2wt％，再加入等体积0.1125～0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重组蛋白溶液，37℃振摇反应2～12小时使羧化乳胶与RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联，加入0.1mol/L甘氨酸终止反应，离心弃上清，沉淀用1wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭后，悬浮于含有稳定剂、封闭剂和防腐剂的缓冲液中，即得RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。