[发明专利]基于一氧化氮合成酶NOS的重金属铜细胞毒性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种重金属毒性技术领域的方法，具体是一种基于一氧化氮合成酶NOS信号通路介导的重金属铜细胞毒性的检测方法。

背景技术

重金属铜是生物体内必需的一种微量元素，是多种酶的辅助因子，参与生物系统内的电子转移。同时，研究表明，铜离子暴露后，产生大量活性氧，导致乳腺癌上皮细胞凋亡。在神经细胞中，铜暴露导致的细胞凋亡和细胞内NO合成量上升有关。一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)是一类同功酶，是生物体内唯一一类专一性的以L‐精氨酸(L‐Arginine)为底物，利用氧气生成一氧化氮(NO)的酶。NO是一种可溶性气体，作为信号分子，参与体内众多的生理和病理过程，在体内担任重要的生理调节作用。NOS单体不具备催化产生NO的活性，而与细胞内的活性氧积聚有关。有报道表明NO参与氧化胁迫促使细胞凋亡。但重金属铜的具体毒性机制，尤其是与信号传导相关的分子机理尚不完全清楚。因此，在信号通路层面，通过重金属铜对NOS信号通路的作用机制进行毒理研究，阐明铜的致毒机理，对重金属污染的毒性检测、生物安全性评估和治疗重金属中毒及其相关疾病就显得尤为重要。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于一氧化氮合成酶NOS的重金属铜细胞毒性的检测方法，利用重金属铜可以通过取代NOS二聚体中的锌离子和钙离子，使NOS二聚体解聚，NO合成量下降，NOS的mRNA表达出现反馈性的上调、以及NOS二聚体的解聚伴随着NOS单体数量的上升，细胞内活性氧含量上升，细胞翻译起始因子磷酸化，蛋白合成停止，最终导致细胞活性下降的毒性机制，建立NO合成量的下降与细胞活性降低之间的信号通路关联性，从而通过直接测定NO合成量的降低百分比来用于进行重金属铜细胞毒性的快速检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种一氧化氮合成酶NOS的应用，利用重金属铜能够使其二聚体解聚的特性，将其用于重金属铜细胞毒性的检测。

所述的细胞毒性是指：由于重金属铜导致的细胞活性下降。

所述的重金属铜细胞毒性的检测，包括以下步骤：

1)模式细胞的培养，具体为：人乳腺癌MCF‐7细胞用含10％胎牛血清的普通含酚红DMEM培养基在37℃、5％CO₂培养箱中培养。实验前细胞接种于35mm培养皿，24h,贴壁。

2)使用步骤1的模式细胞进行产物NO的检测，具体为：1mM重金属铜暴露30min后，裂解细胞，10000rpm，4℃离心5min，取各管上清液50μL于96孔板，一氧化氮检测试剂盒检测产物NO，540nm测定吸光度，根据标准曲线计算细胞内NO含量。

3)根据步骤2的结果进行细胞内锌离子和钙离子的检测，具体为：1mM重金属铜暴露30min后，Ca2+指示剂Fluo‐3/AM孵育40min,检测荧光信号，激发波长：488nm,发射波长：525nm；50μM TSQ探针孵育30min，检测荧光信号，激发波长：334nm,发射波长：485nm。

4)根据步骤2的结果进行NOS的mRNA表达检测，具体步骤包括：

4.1)1mM重金属铜暴露后，用高纯总RNA快速提取试剂盒提暴露后细胞总RNA；

4.2)取500ng总RNA，用反转录试剂盒，37℃反应15min，再85℃5s使反转录酶失活；

4.3)实时定量PCR定量，用2‐ΔΔCt方法分析基因的相对表达量。基因扩增的特异性由熔解曲线保证，PCR反应条件为95℃预变性30s，PCR循环如下：95℃变性5s，60℃延伸34s，40个循环。

5)根据步骤4的结果进行NOS的蛋白表达及细胞翻译起始因子磷酸化表达的检测，具体为：1mM重金属铜以及1mM重金属铜和25mM LNAC共处理后，收集细胞，完全裂解细胞，12000rpm，4℃，离心3min。吸取上层清液，测蛋白浓度。上样，电泳，200V，跑35min；转膜，150V，50min；封闭30min；一抗(nNOS，eNOS，iNOS，β‐actin，p‐elF2α)，4℃，摇床孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育30min；显影，成像。

6)根据步骤5的结果进行细胞内活性氧含量的检测，具体为：1mM重金属铜，1mM重金属铜和10mM L‐Arg，1mM重金属铜和25mM LNAC共处理后，10mM DHR，37℃孵育5min，检测荧光信号，激发波长：488nm，发射波长：525nm。