[发明专利]生物电镜样品碳化方法

说明书

本发明属生物样品制备领域，具体涉及一种生物电镜样品碳化方法。本发明中采用0.1M四氧化锇液体的挥发性气体对生物有机样品进行熏蒸、灼烧，使生物有机样品达到完全碳化符合扫描电镜观察的要求，本发明方法制得的生物电镜样品有更好的表达结果，且环保低碳、操作简便、整个样品的化学物理收缩率小、形貌结构几乎无改变，细微结构清晰。本发明突破了一些电镜样品制备的瓶颈，使一些原来无法制备的透射电镜样品、扫描电镜样品能够顺利完成样品制备达到电镜观察要求，本方法可用于生物样品组织、细菌、有机高分子蛋白体或有机高分子物质生物电镜样品制备。

技术领域

本发明属生物样品制备领域，具体涉及一种生物电镜样品碳化方法

背景技术

电子显微镜诞生以来，研究人员对用于电子显微镜观察的生物样品的前期制备、切片、染色的技术进行不断的探索与改进，以求获得更高品质的真实图象和实验结果。

常规的透射生物电镜样品制备有包埋切片法，负染色法等。而常规的扫描电镜样品制备常采用单一的临界点干燥法(临界点仪器冷冻干燥法，又称冷冻干燥法)，一般的操作步骤为，取材大小在0.8mm平方以内，用2.5％戊二醛2ml，固定2小时或者更长时间，0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15分钟，然后用1％四氧化锇2ml固定2小时，0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15分钟，50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、各一次，每次15分钟，100％乙醇三次、每次15分钟，100％乙醇与醋酸已戊脂1:1混合，一次20分钟，纯醋酸已戊脂一次20—30分钟，临界点干燥。又莱卡现在有新的临界点干燥无需醋酸已戊脂浸透过程，直接从100％乙醇进入临界点干燥。

现有技术中生物样品常规透射电子显微镜样品制备如：心、肝、脾、肺、肾、皮肤、肌肉、等以及各种类型的培养细胞的电镜样品都已经有一系列的完整的方法，其中不乏试剂的选择变化，如：不同环氧树脂国产的618(E51)、进口的Epon812与低粘度的Spurr的选择变换。透射电镜样品处理的一般方法：取材、前固定、漂洗、后固定、漂洗、乙醇梯度(50％、70％、90％、)乙醇90％与丙酮90％1:1混合液、100％*3次脱水。实践显示，在生物组织临界点干燥时，把控时间存在难度，在临界点干燥仪器工作过程中，组织样品体积内部的压力从开始的二氧化碳液体的50kg大气压上升达110大气压工作点，然后在进行排压放气，该过程中由于组织内、外部压力易形成一个倒压差，易使组织发生爆裂，严重影响实验效果。以细菌为例，经过常规的扫描电镜样品制备、脱水与临界点干燥后，少有细菌是饱满的原来的生态结构，细菌常出现大量凹凸的形态结构，不能达到基本完整的细菌原样。

现有技术中对于细菌、病毒、分子蛋白的透射电镜的观察可以用磷钨酸负染色法进行。但是，有些样品受到临界点条件制约，无法进行样品的临界点制备条件，不能进行扫描电镜观察。如：氢化蓖麻油与脂肪醇聚氧乙烯醚(21)混合物、牛油树脂与tween80混合物，多聚赖氨酸等，目前尚无法对这些样品进行临界点干燥。一些有机高分子材料如多聚赖氨酸等，在没有进行样品电子修复的情况下，观察效果始终不能达到理想的结果或根本无法观察；另外，对于油脂类脂滴粒径电镜测定，尚无有令人满意的样品制备方法。

本申请的发明人针对现有技术的现状，拟提供一种生物电镜样品碳化方法，使一些原来无法制备的透射电镜样品、扫描电镜样品能够顺利完成样品制备达到电镜观察要求。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种用于电子显微镜的生物电镜样品碳化方法

本发明方法改变了一些常规的电镜样品制备方法，在整个实验过程中对于实验结果有更好的表达结果，且环保低碳、操作简便、整个样品的化学物理收缩率小、形貌结构几乎无改变，细微结构清晰。

本发明中：采用0.1M四氧化锇液体的挥发性气体对生物有机样品进行熏蒸、灼烧，使生物有机样品达到完全碳化以符合扫描电镜观察的要求，本发明突破了一些电镜样品制备的瓶颈，使一些原来无法制备的透射电镜样品、扫描电镜样品能够顺利完成样品制备达到电镜观察要求。