[发明专利]一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置

说明书

技术领域

本发明属于全内反射荧光显微和共聚焦显微结合的领域，尤其涉及一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置。

背景技术

目前要实现样品的轴向的高精度定位，必须通过三维扫描的方法得到三维重构结果才可对样品内各部分进行轴向定位，该方法耗时且操作步骤较为复杂。本发明提出了一种无轴向扫描的高精度轴向定位方法及装置，采用全内反射显微镜的宽场照明以及共聚焦显微镜的点扫描接收方法，通过离焦差分探测的方法实现对倏逝波激发的样品表面薄层内进行轴向高精度定位。

其中全内反射荧光显微镜是通过光在样品表面发生全内反射时产生的倏逝波照明样本，仅激发样品表面薄层范围内的荧光基团，从而提高了显微成像在纵轴上的空间分辨率，而在薄层内部则无法对样品各部分实现轴向定位。

共聚焦显微镜可通过对样品的三维扫描实现对样品的三维重构，从而得到样品的轴向信息，对样品进行高精度的轴向定位。本方法采用全内反射荧光显微镜的照明方式和共聚焦显微镜的荧光接收方法，将宽场照明方式与点扫描接收方法相结合，通过离焦差分探测的方法，无需轴向扫描，仅通过横向扫描即可实现样品表面薄层内的轴向高精度定位。

发明内容

本发明提供了一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法及装置，相对于其他轴向定位方法，该装置是基于全内反射荧光显微镜，照明方式简单，只激发样品的表面薄层，大大降低了背景噪声；在探测部分，基于点扫描接收的方式提出了一种离焦差分探测的方法，省去了三维扫描的方式，仅通过二维扫描即可实现在样品薄层内(亚微米级)的纳米级轴向高精度跟踪定位。

一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位方法，包括以下步骤：

1)准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦，再通过物镜照射到样品表面发生全反射产生倏逝波，激发样品表层发出荧光；

2)收集的荧光经聚焦透镜后分为两路光束，一路光束由位于聚焦点前的探测器接收，另一路光束由位于聚焦点后的探测器接收，得到样品表层的焦前图和焦后图；

3)控制样品轴向移动，重复步骤1)和步骤2)中的操作，得到样品不同深度下的焦前图和焦后图；

4)对步骤3)中的焦前图和焦后图进行差分处理，将深度与差分结果进行拟合，得到深度和差分结果的标定曲线；

5)对样品表层的焦前图和焦后图进行差分处理，根据所述的标定曲线，实现样品表层各区域的轴向定位。

在步骤2)中，采用扫描振镜对样品不同部分发出的光进行扫描接收。

在步骤1)中，准直后的照明光束经长焦距透镜聚焦在显微物镜的后焦平面上，使得透过显微物镜的照明光束为平行出射光，且入射样品表面的角度大于临界角。

本发明还提供了一种基于倏逝波照明的轴向高精度定位装置，包括：

沿光路依次布置的激光器、准直透镜、长焦距透镜、显微物镜和纳米平移台，该纳米平移台上放置有样品；

沿接收荧光光路依次布置的第一扫描振镜、会聚透镜、分光器，以及分别位于会聚透镜的聚焦点前和聚焦点后的第一光电探测器和第二光电探测器；

和用于控制纳米平移台和数据处理的计算机。

其中，所述长焦距透镜和显微物镜之间依次设有第一反射镜、二色镜和第二反射镜，用于改变长焦距透镜出射光路的方向，使整个装置的结构更加紧凑。

同时，所述的准直透镜和长焦距透镜之间设有第二扫描振镜。

同时，还包括分别与第一光电探测器和第二光电探测器相适应的第一探测小孔、第二探测小孔。

在本发明中：激光器为光纤激光器，用于发出激光，实现对荧光样品的照明激发；准直透镜用于对光纤激光器发出的发散光进行准直；长焦距透镜，与准直透镜一起构成一个4f系统，用于将平行光束聚焦于物镜的后焦平面；显微物镜，使聚焦于物镜后焦平面的激发光束平行出射以一定角度入射于样品表面；纳米平移台，用于控制样品纳米级的轴向移动；扫描振镜，通过控制扫描振镜使得样品表层上的横向位置上的不同点发出的光被探测器接收，实现对样品表层的二维扫描；会聚透镜，用来会聚接收到的荧光；第一探测小孔、第二探测小孔，分别置于会聚透镜的焦前与焦后，滤除其他横向位置的点发出的光；第一光电探测器、第二光电探测器，分别接收第一探测小孔、第二探测小孔接收到的光强信息；计算机，用于控制纳米平移台的轴向移动，处理两个探测器的信号。

针对上述的轴向高精度定位装置，具体过程如下：