[发明专利]靶向OLFM4基因的干扰RNA、慢病毒及其应用

权利要求书

1.一种靶向OLFM4基因的干扰RNA，其核苷酸序列如下:

正义链：5′

-CCGGAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTTTTTTTG-3′，即SEQ ID NO.1；

反义链：5′

-AATTCAAAAAAACGCTTGGAATTCACAGCTCCTCGAGGAGCTGTGAATTCCAAGCGTT-3′, 即SEQ ID NO.2。

2.包含权利要求1所述的靶向OLFM4基因的干扰RNA的Lentivirus慢病毒，所述慢病毒载体的结构如图1所示。

3.如权利要求2所述的Lentivirus慢病毒，制备方法包括以下步骤：

（1）体外合成上述DNA序列；

（2）退火配对产生DNA双链，通过两端所含的酶切位点AgeI与EcoRI连入酶切后的GV115载体；

（3）将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，抽提DNA重组质粒；DNA测序验证阳性重组克隆；

（4）Lentivirus病毒包装：

① 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/20 ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5% CO₂ 培养箱内培养，24 h后待细胞密度达70%～80%用于转染； 

② 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基；

③ 向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体 20 μg ，pHelper 1.0载体15 μg，pHelper 2.0载体10 μg)，与相应体积的Opti-MEM培养基混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5分钟；

④将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，吸取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟；

⑤把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，在5分钟之内混合； 

⑥ 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物；

⑦ 将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃, 5%CO₂细胞培养箱中培养；

⑧ 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去；

⑨ 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO₂培养箱内继续培养48小时；

（5）病毒的收获及浓缩 

① 收集转染后48小时的293T细胞上清液；

② 4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片； 

③ 以0.45μm滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中； 

④ 把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中；

⑤ 组合好后，做好平衡，放在转头上； 

⑥ 在4000×g离心10-15分钟，至需要的病毒浓缩体积； 

⑦ 离心结束后，叏出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；

⑧ 将过滤杯倒扣在样品收集杯上；

⑨ 离心力不超过1000g,时间为2分钟；把过滤杯从样品收集杯上移开；样品收集杯中的即为病毒浓缩液；

⑩ 将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定；

（6）Lentivirus滴度测定 

① 测定前一天，293T细胞铺96孔板，贴壁生长，每个孔加4×10⁴个细胞，体积为100μL；

② 根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管，每管加入90μl的无血清培养基；

③ 取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；

④ 选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃；加入90μl稀释好的病毒溶液；放入培养箱培养； 

⑤ 24小时后，加入完全培养基100μl； 

⑥ 4天后，观察荧光表达情冴观察荧光表达情况；荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少；

⑦滴度计算：根据荧光图片中GFP表达情况。