[发明专利]修饰型生物素结合蛋白

说明书

本申请是申请日为2009年8月13日、申请号为200980140630.6(国际申请号为PCT/JP2009/064302)，名称为“修饰型生物素结合蛋白”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本申请要求2008年8月13日提出的日本国专利申请2008-208766的优先权。

本发明涉及修饰型生物素结合蛋白。

背景技术

抗生物素蛋白是卵清来源的蛋白质，链霉菌抗生物素蛋白是放线菌(Streptomyces avidinii)来源的蛋白质。抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白与生物素(D-[(+)-cis-六氢-2-氧代-1H-噻吩并-(3,4)-咪唑-4-戊酸]之间的亲和性(affinity)非常高(KD＝10^-16～-14)，是两生物分子间相互作用之中最强的相互作用之一。分子量是60kDa左右。现在，抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白-生物素相互作用在生物化学、分子生物学或医学领域有着广泛应用(Green,(1975),Adv.Protein Chem.,29:85-133；Green,(1990),Methods Enzymol.,184:51-67)。抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白这两种蛋白质均形成四聚体，每一个亚基结合1分子的生物素。

在抗生物素蛋白的利用方面，其非特异性结合是一个问题。抗生物素蛋白有些情况下与细胞、DNA、蛋白质或膜这些生物体成分非特异性结合，例如，在使用抗生物素蛋白-生物素结合对物质进行检测时，有些情况下抗生物素蛋白与检测对象物质以外的物质发生非特异性结合，导致背景增高。作为抗生物素蛋白的非特异性结合高的理由，可以列举出等电点高、具有分子量的约10％的糖链、等等。抗生物素蛋白是强碱性蛋白质，其等电点为10以上非常之高，整体上带有正电荷，因而可以认为其容易与带负电荷的物质居多的生物体成分发生结合。

此外，可以认为，抗生物素蛋白表面的糖链容易与生物体成分结合(Marttila等，(2000)FEBS Lett,467,31-36)。为了降低抗生物素蛋白的非特异性结合，进行了下述的研究：利用糖苷酶除去抗生物素蛋白的糖链而得到的化学修饰中性抗生物素蛋白的研究(Bayer等，(1995)Appl Biochem Biotechnol,53(1),1-9)，通过将抗生物素蛋白中的糖基化靶点即17位的天冬酰胺残基取代成异亮氨酸残基来生物合成不受糖链修饰的抗生物素蛋白的研究(Marttila等，(2000)FEBS Lett,467,31-36)，等等。而且，还进行了通过采用基因工程方法将抗生物素蛋白所具有的赖氨酸残基、精氨酸残基变换为中性氨基酸、酸性氨基酸，来降低抗生物素蛋白的等电点的研究(Marttila等，(1998)FEBS Lett,441,313-317)。

然而，通过这样的修饰，虽然例如DNA、细胞针对抗生物素蛋白的非特异性结合得以降低，但关于在应用于临床检查系统等时所必须的针对人血清的非特异性结合的抑制，尚未进行充分研究。此外，在生物合成抗生物素蛋白变体时，有必要使用基于昆虫细胞的表达系统。因此，现状是因培养需要时间及成本高，序列修饰抗生物素蛋白尚未达到实用化。

作为关于抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白这样的生物素结合性蛋白质与生物素之间的亲和性的研究，有报告称，对链霉菌抗生物素蛋白的结构进行大的修饰，增强了其与荧光生物素的结合(Aslan等，(2005)Proc Natl Acad Sci U.S.A.,102,8507-8512)。但是，该蛋白质同时大幅损失了与生物素的结合能力。