[发明专利]一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺中间体的方法

说明书

技术领域

一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺中间体的方法，属于微生物基因工程领域。本发明还涉及一种多佐胺中间体的制备，该化合物可以用来制备治疗青光眼用药多佐胺。

背景技术

青光眼是一类以特异性视神经损害和视野缺损为特征的眼病，是目前主要的、不可逆性的致盲眼病之一。而多佐胺是一种局部眼用碳酸酐酶抑制剂，广泛用于高眼压症、青光眼等，全身性不良反应少。多佐胺由美国默克公司自主研发，是第一个获美国FDA批准的首只碳酸酐酶抑制剂，于1995年在美国上市。

多佐胺(Dorzolamide)：由默沙东公司开发商品名“舒净霹”(Trusopt)，FDA于1994年12月批准的首只眼用CAI，适用于β-受体阻滞剂治疗无效的原发性开角型青光眼和剥脱综合征继发性青光眼。本品于1998年1月8日在中国获行政保护，已于2005年7月8日终止，但目前尚未进口，亦无国内企业生产及申报。多佐胺结构见附图1：

多佐胺的化学合成中涉及到手性中间体的合成，而常规的合成路线选择性不明显，且手性化合物合成成本较高，因此导致终产品的成本升高；而有的合成路线经过改良，缩减了反应步骤，操作简单，但反应产品的构型几乎都是不需要的顺式异构体。因此，有必要需找一条更加经济、高效的制备方法。

发明内容

针对目前化学合成法获得多佐胺成本高，污染大，提取率低的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺关键中间体的方法。

本发明通过将经密码子优化后的乙醇脱氢酶基因连接商业化的表达载体上，在大肠杆菌中过量表达该乙醇脱氢酶，以多佐胺中间体(6S)-甲基酮砜为底物，催化产生多佐胺的手性中间体。

本发明所述的一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺手性中间体的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：利用公布的乙醇脱氢酶的基因序列，按照大肠杆菌偏爱的密码子进行突变，通过引入酶切序列，将全基因合成并引入pET-28a表达质粒上，构建了可表达乙醇脱氢酶的重组质粒pET-mADH将所构建的重组质粒pET-mADH转化至大肠杆菌中，得到过量表达乙醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌。

其中，所述的乙醇脱氢酶结构基因来源于来源于粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)。

上述表达乙醇脱氢酶基因的载体为pet-28a，该质粒来源于Novagen公司。

本发明所述重组大肠杆菌的构建步骤：

1.乙醇脱氢酶基因的优化

基本方法是根据粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)的乙醇脱氢酶基因，通过优化乙醇脱氢酶的密码子，消除一些低使用率的密码子，同时通过同义转换，优化mRNA的一级结构，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。并利用同义转化方法消除NdeI和XhoI酶切位点。通过个全基因合成，合成乙醇脱氢酶基因。

2.乙醇脱氢酶基因表达载体的构建

基本方法是通过全基因合成的方法合成优化后的乙醇脱氢酶基因，然后根据设计的酶切位点，将乙醇脱氢酶基因片段连接到pET-28a质粒上，构建重组质粒pET-mADH。

3.乙醇脱氢酶重组表达菌株的构建

基本方法是将所构建的重组质pET-mADH转化至大肠杆菌中，从而获得过量表达乙醇脱氢酶的重组大肠杆菌。

本发明所述重组大肠杆菌在生产多佐胺中间体中的应用，具体方法是：

挑取重组大肠杆菌单菌落接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，37℃、200rpm过夜培养后，按2％接种量接入250mL摇瓶完全培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，pH7.0-7.2)，在旋转式摇床中30℃、200rpm培养24h。超声破菌，离心收集酶液，在pH4.0，以(6S)-甲基酮砜为底物，催化产生多佐胺的手性中间体。

附图说明

附图1多佐胺的结构式

附图2pET-mADH的结构示意图

附图3纯化后的乙醇脱氢酶HPLC图

具体实施方式

一般性说明：实施例所涉及的酶均购自promega公司，质粒提取试剂盒与琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自omega公司，操作完全按照相应说明进行。全基因合成由上海生工公司完成。

LB培养基(％)：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，pH7.0-7.2。

Kan抗性平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaC，卡纳青霉素50μg/ml。