[发明专利]一种肺癌预后预测miRNA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医用诊断技术领域，涉及肺癌的预后领域，主要是肺癌化疗后死亡危险度的预测，特别是涉及用于肺癌诊断的一组外周血miRNA的检测方法和应用。

背景技术

肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，在中国，肺癌的发病率逐年升高，死亡率也是位居肿瘤死亡首位。据世界卫生组织(WHO)估计，截至2025年，我国每年肺癌死亡病例将达到100万(JemalA，BrayF，CenterMM，etal.Globalcancerstatistics.CACancerJClin，2011，61(2)：69-90；SheJ，YangP，HongQ，etal.LungcancerinChina：challengesandinterventions.Chest，2013，143(4)：1117-1126.)。近年来，尽管肺癌的诊断和临床治疗已取得很大进展，但患者的总生存时间仍很短，5年生存率不超过15％。目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，II-IV期肺癌患者5年生存率大约在40％-5％之间，而I期患者5年生存率可高达92％。

基于外周血的分子标志物筛选是多年来肿瘤早期诊断研究的热点，因为血液检测微创，成本相对较低，可重复性高。其中，血清microRNA(miRNA)作为肿瘤标志物是目前最有吸引力的分子标志物。因为血清miRNA容易分离，并且非常稳定，即便是在苛刻的条件下，如反复冻融和pH值改变等环境下也不容易降解。miRNA是近年来发现的一类长度为19-25个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶标基因3′UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。

目前已经证实，miRNA在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性(LuJ，GetzG，etal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature.2005，435(7043)：834-838；ChoWC.Oncomirs：thediscoveryandprogressofmicroRNAsincancers.MolCancer.2007，6：60)。并且miRNA在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，同时与RNA比较，其表达稳定性更为显著。研究表明通过检测血浆或血清中的miRNA以诊断疾病是可行的、稳定的及具有可重复性的。因此，有必要也有可能寻找血循环中的特异的肿瘤标志物，以期建立一种无创、快速、稳定且经济的肺癌诊断方法。

发明内容

目前肿瘤标志物和其他无创的筛选手段存在灵敏度低、特异性差以及对仪器设备要求较高的问题，为了解决这一问题，本发明的目的是选取肺癌特异性的miRNAs作为肿瘤标志物。本发明的目的是提供一种检测外周血miRNA表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该试剂盒适用于目前市场上存在的各种类型的荧光定量基因扩增仪，定量快速准确、灵敏度高、稳定性好、具有良好的应用前景。

本发明的另一目的是提供了一种荧光定量PCR试剂盒，其通过检测肺癌病人外周血中miRNA的水平对肺癌预后预测进行快速的检测。

为了实现上述目的，本发明通过收集首诊患者并且术前未接受辅助化疗，术后辅助化疗的病人进行跟踪检测，对不同肺癌患者和正常人外周血样品，进行全基因组miRNA差异表达分析，发现及验证不同肺癌外周血特异性miRNA，检测候选miRNA表达谱在这些样本中的表达，统计分析药物治疗前后miRNA的改变与预后关系的相关性，将筛选出的特异的miRNAs用于在肺癌高危人群中早期肺癌诊断及病人预后预测。

本发明人在研究中发现hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p在术后辅助化疗的病人中有明显的表达量变化，其表达量与病人的预后呈正相关关系。将hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p作为肺癌筛查的分子标志物具有非常重要的应用价值。前期研究表明hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p的表达水平高低与病人的预后具有明显的依赖关系。作用于肺癌的治疗后的复发、转移及预后预测具有非常重要的临床意义。

该组生物标志物还可以应用于肺癌的诊断。

此外，本发明还提供了一种利用上述生物标志物进行肺癌预后预测的方法，具有包括以下步骤：

(1)收集人外周血样本；

(2)提取血清中总RNA；