[发明专利]一种高效提高钝齿棒杆菌SYPA5-5 L-精氨酸生产能力的代谢改造方法

说明书

技术领域

本发明以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5为出发菌株，通过应用解除L-精氨酸对其合成途径限速酶—N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase, NAGK, argB)的反馈抑制作用，同时加强表达argGH基因的代谢改造策略，可有效提高该菌株L-精氨酸生产能力，属于生物技术领域。

背景技术

L-精氨酸(L-Arginine)为半必须氨基酸，是尿素循环的重要中间代谢产物，因具有多种重要的生理功能而广泛应用于医药、食品及化工领域。微生物发酵法有节能环保、易提取分离等优点，具有重要的工业化应用价值。

目前，全世界L-精氨酸需求量在15000吨以上，而实际发酵法生产L-精氨酸达仅有8000吨，生产地主要集中于日本及欧洲等国家，而且需求量以12%-15%的速度增长。我国虽然有一些厂家可以生产L-精氨酸，但是大多数厂家都是粗品氨基酸精制，且产量非常有限，绝大多数L-精氨酸依赖于进口，L-精氨酸的价格约为14万人民币/吨。L-精氨酸是国内氨基酸发酵工业的瓶颈，通过选育L-精氨酸高产菌株，实现发酵法生产迫在眉睫。

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5是本研究室经过多级诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，以葡萄糖为主要碳源，发酵96h，可积累约30 g/L L-精氨酸。与工业生产的L-精氨酸生产菌株相比，该菌株仍然存在L-精氨酸生产能力低，发酵周期长的缺点，仍需进一步改造以提高L-精氨酸生产能力及缩短发酵周期。

代谢工程技术作为理性改造的重要手段广泛应用于工业微生物的改造，也成功应用于L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸等氨基酸高产菌株的构建。本研究以SYPA5-5为出发菌株，运用代谢工程手段，对其L-精氨酸合成途径的限速步骤实施改造，探讨改造后菌株代谢发生变化的机制，强化L-精氨酸的合成途径。

发明内容

本发明提供一种有效提高钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5积累L-精氨酸的代谢改造策略。该策略以SYPA5-5为出发菌株，通过应用解除L-精氨酸对其合成途径限速酶—N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase, NAGK, argB)的反馈抑制作用，同时加强表达argGH基因的代谢改造策略，可有效提高该菌株L-精氨酸生产能力。本发明提供的方法属于基金项目：国家863资助项目（No. 2012AA022102）的研究内容。

具体的发明方案如下：

1.在SYPA5-5中解除L-精氨酸对NAGK的反馈抑制作用

(1) 构建重组质粒pK18mobsacB-argB_H268N

从NCBI中获取argBD序列，设计相关引物，以SYPA5-5基因组为模板，并以argB-F/H268N-R、H268N-F/argD-R为引物，分别扩增获得H268N-5'/ H268N-3'同源片段，以同源片段为模板，以argB-F/argD-R为引物，扩增获得有H268N突变点的argBD片段，约1863 bp。将该突变片段连入pK18mobsacB质粒，获得重组质粒pK18mobsacB-argB_H268N。