[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用。

背景技术

结核分枝杆菌是结核病的病原体，是人类病原体中最能适应人体环境的一种，它可以以潜伏状态在人体巨噬细胞内存在很长时间。据估计，全球有20亿人口被结核分枝杆菌潜伏感染，其中这一人群中有10％的人口在免疫功能低下时由潜伏期结核进展为活动性结核。对于结核病的控制策略很大程度上依赖于至少三种不同抗痨药物长期的治疗。其结果是，多重耐药的不断发展造成控制结核病的巨大障碍。在结核病发病率最高的国家，人们最为需要的并不是去获得治疗，而且许多患者对抗痨治疗是无效的，显而易见，研制一种新的抗结核疫苗是目前最为迫切的需要。目前所使用的结核疫苗卡介苗(BCG)，自1921年开始应用于临床，是一种减毒牛结核分枝杆菌活疫苗。研究证实，它能够有效预防新生儿和儿童患上严重的脑膜结核及全身粟粒性结核病，但是不能有效的防止成人肺结核的发生。继BCG疫苗应用80多年以来，全球尚未研制出有效的新型抗结核疫苗。因此，为了在全球范围内彻底消灭结核病，我们迫切需要研制更为有效的结核病新型疫苗。

相关研究证实，切实有效的结核病疫苗不但要对活动期结核病具有保护作用，而且要能够针对潜伏期结核菌起作用。因此，理想的结核亚单位疫苗必须融合结核分枝杆菌生长期及潜伏期的多个抗原。本发明涉及结核杆菌的五个抗原：ESAT6、Ag85B、MPT64、Mtb8.4和HspX，其中ESAT6、Ag85B、MPT64和Mtb8.4四个抗原是由生长期结核菌分泌，申请人前期以这四种生长期抗原构建了EAMM疫苗(《一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用》；公开号：CN102180974A)。通过研究发现，EAMM疫苗(由结核菌生长期抗原融合构成)和含有结核菌潜伏期抗原HspX的Mt b10.4-HspX(MH)疫苗进行联合应用时(即EAMM+MH疫苗)，MH疫苗由于含有潜伏期抗原,在一定程度上明显增强了EAMM疫苗的保护效果(Xin Q,Niu H,Li Z,et al.(2013)Subunit Vaccine Consisting of Multi-Stage Antigens Has High Protective Efficacy against Mycobacterium tuberculosis Infection in Mice.PLoS ONE8(8):e72745.doi:10.1371/journal.pone.0072745)。ESAT6、Ag85B、MPT64和Mtb8.4抗原均具有较强的免疫原性，且对结核分枝杆菌均据有一定的保护效果，是构建结核疫苗的经典抗原，其各自特性在上述所提到的EAMM专利中已有陈述。结核分枝杆菌HspX抗原属于热休克蛋白家族，是休眠期结核菌所分泌的主要抗原，对结核菌在巨噬细胞内的生存起到关键性地作用。此外，该抗原所诱导产生的IFN-γ水平在与结核病人密切接触的医务人员及家属中明显高于健康人群，提示该抗原是结核菌潜伏期的抗原且可以诱导Th1型的免疫应答。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用基因工程的方法将HspX抗原串联在EAMM融合蛋白的后面，构建的新的融合蛋白EAMMH。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种结核分枝杆菌融合蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

本发明的第二个目的是提供了编码上述结核分枝杆菌融合蛋白的核苷酸。

进一步的，上述的核苷酸，其序列如序列1所示。

本发明的第三个目的是提供了包含有上述核苷酸的载体。

进一步的，上述的载体，为重组基因载体pET30a(+)-EAMMH；所述EAMMH即为核苷酸ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX。

本发明的第四个目的是提供了包含有上述载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供了上述结核分枝杆菌融合蛋白的构建、表达和纯化方法，是将融合抗原EAMM和单个抗原HspX进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)-EAMMH，再将pET30a(+)-EAMMH质粒载体转化入大肠杆菌E.coli中进行融合蛋白EAMMH的表达，通过盐析和柱层析的相结合的方法纯化结核分枝杆菌融合蛋白。

进一步的，上述的结核分枝杆菌融合蛋白的构建、表达和纯化方法，包括以下步骤：

1)融合蛋白EAMMH表达质粒pET30a(+)-EAMMH的构建：