[发明专利]鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法

说明书

本发明提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，采用Real‑Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因(即内参基因)，与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数，再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。

技术领域

本发明涉及转基因植物检测技术领域和作物育种领域，具体地说，涉及一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法。

背景技术

目前，植物转基因领域应用较为成熟的转化方法包括基因枪法和农杆菌介导转化法两种。在这两种方法中，外源基因均被随机地插入到植物基因组中，通常情况下一般会在染色体上插入一个或多个外源基因拷贝。大量实验表明，多拷贝插入往往会造成转化植株出现外源基因表达沉默现象，往往只有插入单拷贝或双拷贝的外源基因才会在转基因植物中高水平表达。此外，对于转基因育种行业，能够筛选得到T0代外源基因单拷贝插入植株，将使后续外源基因mRNA及蛋白层面上的筛选更加可靠，同时也更有利于筛选得到稳定遗传的转基因纯合植株，加快植物育种进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法。

本发明采用Real-Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因(即内参基因)，与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数，再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。

为了实现本发明目的，本发明的一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，包括以下步骤：

1)提取待测转基因植物基因组DNA；

2)筛选目标基因荧光定量PCR引物与内参基因荧光定量PCR引物，保证目标基因和内参基因扩增效率一致；

3)以转基因植物的基因组DNA为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行荧光定量PCR；指定一个荧光信号阈值，根据目标基因和内参基因的循环次数的差值，确定待测转基因植物中的目标基因的拷贝数；

4)筛选低拷贝转基因植株；

5)通过Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。

本发明中涉及的转基因植物是转基因水稻或玉米等。

当所述转基因植物是转基因水稻时，所述目标基因是抗草甘膦基因Epsps-CP4(SEQ ID No.2)，所述内参基因是水稻Actin7基因(SEQ IDNo.7)。目标基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和6所示，内参基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.9和10所示。

对转基因水稻进行荧光定量PCR扩增时，反应体系为：FastStart Universal SYBRGreen Master[ROX]5μl，300nM的正、反向引物各1.25μl、模板DNA2.5μl；反应程序为：95℃10min；95℃10sec，60℃30sec，共28个循环。

当所述转基因植物是转基因玉米时，所述目标基因是绿色荧光蛋白基因GFP(SEQID No.1)，所述内参基因是玉米Ivr1基因(SEQ ID No.8)。目标基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和4所示，内参基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.11和12所示。