[发明专利]一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用有效
| 申请号： | 201410188145.9 | 申请日： | 2014-05-06 |
| 公开（公告）号： | CN104004721B | 公开（公告）日： | 2017-02-01 |
| 发明（设计）人： | 林影;刘慧平;梁书利;韩双艳;郑穗平 | 申请（专利权）人： | 华南理工大学 |
| 主分类号： | C12N9/02 | 分类号： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C02F3/00;C12R1/84 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司44245 | 代理人： | 宫爱鹏 |
| 地址： | 511458 广东省广州市*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 嗜热栖热菌漆酶 工程 重组 应用 | ||
1.一种嗜热栖热菌漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如Seq No.2所示。
2.编码权利要求1所述漆酶的DNA，其特征在于，序列如Seq No.1所示。
3.权利要求2所述DNA在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将权利要求2所述DNA及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求2所述DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到表达载体pHKFA1-lacTT；
(2)通过将表达载体pHKFA1-lacTT化学转化E.coli Top10得到克隆菌株E.coli Top10/pHKFA1-lacTT。
6.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，将权利要求5所述表达载体pHKFA1-lacTT线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得。
7.根据权利要求6所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，其构建方法如下：
将表达载体pHKFA1-lacTT经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)GS115感受态细胞，并在MD平板进行阳性转化子筛选；以MD平板筛选得到的转化子为模板，以TTF和TTR为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子为重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS115/pHKFA1-lacTT，其中TTF和TTR的序列如Seq No.3、4所示。
8.一种重组漆酶，其特征在于，将权利要求6或7所述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。
9.根据权利要求8所述的重组漆酶，其特征在于，其构建方法如下：
挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.1mM CuSO4。
10.权利要求8或9所述重组漆酶在染料脱色中的应用。
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